陳喜填 夏維林 鄭小玲 吳桂香

[摘要]目的 探討實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法監(jiān)測(cè)慢性髓系白血?。–ML）外周血 BCR-ABL融合基因水平的價(jià)值。方法 選取2016年3月～2017年6月我院血液科收治的CML患者35例，應(yīng)用qRT-PCR法檢測(cè)患者的BCR-ABL融合基因水平，并監(jiān)測(cè)不同疾病分期患者BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同BCR-ABL融合基因水平組患者伊馬替尼的治療效果及無病生存期（DFS），患者治療前后的BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果 急變期患者的BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本水平明顯高于加速期和慢性期，加速期患者的BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本水平明顯高于慢性期，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.68，P=0.00）。療效滿意方面：低水平組與中水平組患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但兩組均明顯高于高水平組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中位DFS方面：BCR-ABL融合基因低水平組患者的中位DFS明顯長(zhǎng)于中水平組、高水平組，中水平組的中位DFS明顯長(zhǎng)于高水平組，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.15，P=0.00）。伊馬替尼靶向治療第3、6、12個(gè)月后的BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本水平均明顯低于治療前（P=0.00）;通過伊馬替尼靶向治療，患者的BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本平明顯降低，但前6個(gè)月的下降幅度最明顯。結(jié)論 qRT-PCR技術(shù)可準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)患者外周血BCR-ABL融合基因水平，有利于輔助CML患者疾病的診斷和病情分期，同時(shí)，通過對(duì)CML患者不同時(shí)期外周血BCR-ABL 融合基因水平的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)有利于準(zhǔn)確評(píng)估患者的治療效果和預(yù)后，對(duì)CML患者治療方案的選擇具有重要指導(dǎo)意義。

[關(guān)鍵詞]實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng);慢性髓系白血病;外周血;BCR-ABL融合基因

[中圖分類號(hào)] R733.72? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）1（a）-0011-05

慢性髓系白血?。╟hronic myelocytic leukemia，CML）是臨床常見的造血干細(xì)胞惡性腫瘤疾病，其發(fā)病機(jī)制為22號(hào)染色體的長(zhǎng)臂與9號(hào)染色體的短臂相互易位t（9;22）（q34;q11）形成特征性Ph染色體，分子水平表現(xiàn)為BCR-ABL融合基因形成，并通過BCR-ABL蛋白導(dǎo)致CML發(fā)病。CML起病緩慢，其病程可分為無癥狀期、慢性期（chronic phase，CP）、加速期（accelerated phase，AP）和急變期（blastic phase，BP），隨著病情發(fā)展，患者可出現(xiàn)脾大、發(fā)熱、貧血、出血、胸骨壓痛等臨床癥狀[1-3]。目前，CML的臨床治療中，靶向藥物治療得到快速發(fā)展，顯著提高了CML患者的臨床療效，延長(zhǎng)了其無病生存期（disease free survival，DFS），其中，選擇性酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼通過與 BCR-ABL激酶上的 ATP位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制其酪氨酸激酶活性，阻斷激酶的自身磷酸化及底物磷酸化水平，從而特異性地抑制 BCR-ABL陽性細(xì)胞的增生并誘導(dǎo)其凋亡，從而發(fā)揮治療作用。但近年來，CML患者對(duì)伊馬替尼出現(xiàn)耐藥性的報(bào)道不斷增多，部分CML患者BCR-ABL融合基因水平再度升高，并出現(xiàn)加速或急變?yōu)榧毙园籽《劳鯷4-5]。積極監(jiān)測(cè)CML患者的病情變化，及時(shí)調(diào)整治療方案，降低患者耐藥性和腫瘤的復(fù)發(fā)成為臨床關(guān)注的焦點(diǎn)。故動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) BCR-ABL 融合基因水平對(duì) CML 的療效及預(yù)后的判斷尤為重要。臨床研究顯示[6-9]，CML患者外周血BCR-ABL融合基因水平與患者不同疾病分期具有顯著相關(guān)性，提示可以通過患者外周血BCR-ABL融合基因水平監(jiān)測(cè)其病情的進(jìn)展和變化，但目前國內(nèi)而關(guān)于CML患者外周血 BCR/ABL 融合基因水平在監(jiān)測(cè)CML疾病進(jìn)展情況方面的應(yīng)用較少報(bào)道，且尚需臨床數(shù)據(jù)加以驗(yàn)證。我院自2010年開始，已經(jīng)開展包括 BCR-ABL 融合基因在內(nèi)等白血病相關(guān)項(xiàng)目的檢測(cè)，目前BCR-ABL融合基因水平的監(jiān)測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究就qRT-PCR法監(jiān)測(cè)慢性髓系白血病外周血BCR-ABL融合基因水平的臨床價(jià)值展開研究，旨在為臨床提供參考。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年3月～2017年6月我院血液科收治的CML患者35例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①入院經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、染色體核型分析以及融合基因檢測(cè)等確診為CML，參照2016年版《NCCN白血病防治指南》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];②既往未進(jìn)行相關(guān)化療、靶向藥物治療;③預(yù)計(jì)生存期>12個(gè)月;④患者對(duì)本研究?jī)?nèi)容知情并自愿參加。排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷類型白血病的患者;②合并嚴(yán)重的心、腦、肝、腎等實(shí)質(zhì)性器官疾病的患者;③對(duì)本研究藥物過敏者;④機(jī)體狀況較差，不耐受化療、靶向治療的患者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。35例患者中，男21例，女14例;年齡17～74歲，平均（48.62±6.15）歲;疾病分期：慢性期29例，加速期4例，急變期2例。根據(jù)患者外周血BCR-ABL融合基因水平將患者分為低水平組（BCR-ABL≤10.00%）共11例，中水平組（10.00%50.00%）共8例。

1.2方法

所有患者均于我院進(jìn)行伊馬替尼靶向藥物治療，并借助武漢康圣達(dá)檢驗(yàn)中心檢測(cè)患者BCR-ABL融合基因水平，分別于治療前、治療后第3、6、12個(gè)月各檢測(cè)1次患者外周血BCR-ABL融合基因水平。患者出院后進(jìn)行密切隨訪，記錄患者疾病復(fù)發(fā)或死亡時(shí)間。

1.2.1儀器與試劑? qRT-PCR儀采用美國伯樂CFX96，細(xì)胞裂解液采用TRhol試劑（美國Invitrogen公司），白細(xì)胞分離液采用人淋巴細(xì)胞分離液（天津美德太平洋科技有限公司），融合基因定量檢測(cè)試劑盒購自上海之江生物科技股份有限公司。

1.2.2檢測(cè)方法與步驟? 采用qRT-PCR法檢測(cè)患者的BCR -ABL轉(zhuǎn)錄本水平，具體步驟如下。①RNA提?。撼槿』颊呖崭轨o脈血5 ml置于EDTAK2抗凝管中，混勻，加入人淋巴細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞，加入TRhol試劑裂解白細(xì)胞，經(jīng)氯仿萃取出核酸，并利用異丙醇沉淀提取RNA。②RT-PCR反應(yīng)：將RNA反應(yīng)管、DEPC-H20反應(yīng)管、對(duì)照品和標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)管置于qRT-PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)：45℃，20 min;95℃，5 min;95℃，15 s;58℃，60 s;循環(huán)45次。設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，內(nèi)參基采用ABL。③計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線：利用標(biāo)準(zhǔn)品qRT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增的結(jié)果制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。④計(jì)算樣本BCR-ABL水平：通過樣本Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本起始BCR-ABL值和ABL值，選取ABL≤38的樣本，根據(jù)以下公式計(jì)算BCR-ABL水平。BCR-ABL（%）=（BCR-ABL拷貝數(shù)/ ABL拷貝數(shù)）×100%。上述各項(xiàng)操作和步驟均按照儀器和試劑盒說明嚴(yán)格規(guī)范操作。

1.3觀察指標(biāo)

①不同疾病分期患者BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平;②不同BCR -ABL融合基因水平組患者伊馬替尼的治療效果及預(yù)后;③患者治療前后的BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平變化。

1.4療效標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)患者治療后血象各項(xiàng)指標(biāo)變化、Ph+細(xì)胞水平以及BCR-ABL水平將患者的臨床療效分為以下幾點(diǎn)。①血液學(xué)緩解（complete hematologic remission，CHR）：外周血白細(xì)胞（white bloodcell，WBC）≤10×109/L，WBC分類正常，血小板<450×109/L，無髓外白血病浸潤，無幼稚粒細(xì)胞，維持4周;②部分細(xì)胞遺傳學(xué)緩解（partial cytogenetic remission，PCyR）：Ph+細(xì)胞≤35%和（或）BCR-ABL≤10%;③完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解（complete cytogenetic response，CCyR）：少檢查20個(gè)核分裂象，Ph+細(xì)胞為0和（或）BCR-ABL<1%;④分子學(xué)緩解（major molecular response，MMR）：BCR-ABL<0.1%。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)參照參照中國2013年版CML治療指南。

療效滿意為3個(gè)月達(dá)到CHR和PCyR，6個(gè)月達(dá)到CCyR，12個(gè)月達(dá)到MMR;療效警告為3個(gè)月BCR-ABL>10%和（或）Ph+細(xì)胞36%～95%，6個(gè)月BCR-ABL 1%～10%和（或）Ph+細(xì)胞1%～35%，12個(gè)月BCR-ABL為0.1%～1%;治療失敗為3個(gè)月未達(dá)到CHR和（或）Ph+細(xì)胞100%，6個(gè)月Ph+細(xì)胞>35%和（或）BCR-ABL>10%，12個(gè)月Ph+細(xì)胞≥1%和（或）BCR-ABL>1%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析;計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 不同疾病分期患者BCR-ABL轉(zhuǎn)錄水平的比較

急變期患者的BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本平為（97.93±2.16）%，明顯高于加速期的（86.35±5.37）%和慢性期的（30.28±15.92）%，加速期患者的BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本平明顯高于慢性期，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.68，P=0.00）。

2.2不同BCR-ABL融合基因水平組患者伊馬替尼治療效果及預(yù)后的比較

療效滿意方面：低水平組與中水平組患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但兩組均明顯高于高水平組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中位DFS方面：低水平組患者的中位DFS明顯長(zhǎng)于中水平組、高水平組，中水平組的DFS明顯長(zhǎng)于高水平組，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.15，P=0.00）;三組患者中共有5例患者在伊馬替尼治療第3個(gè)月后無法達(dá)到CHR，通過改用其他合適的治療方案治療第12個(gè)月后，4例患者達(dá)到MMR（表1）。

2.3 CML患者治療前后BCR-ABL融合基因水平的比較

伊馬替尼靶向治療前患者的BCR-ABL融合基因平均水平為（88.464±21.567）%，治療后第3、6、12個(gè)月分別為（9.673±3.257）%、（2.482±0.716）%、（0.043±0.002）%;治療后第3、6、12個(gè)月的BCR-ABL融合基因水平均明顯低于治療前（P=0.00）;通過伊馬替尼靶向治療，患者的BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本平明顯降低，但前6個(gè)月的下降幅度最明顯（圖1）。

3討論

CML起源于多能干細(xì)胞的髓系惡性增生，患者22號(hào)染色體的長(zhǎng)臂與9號(hào)染色體的短臂發(fā)生相互易位，形成特征性Ph染色體，從而產(chǎn)生BCR-ABL融合基因，主要為b3a2和b2a2兩種轉(zhuǎn)錄本形式。研究顯示[10-12]，95%以上的CML患者為BCR-ABL陽性，BCR-ABL融合基因通過轉(zhuǎn)錄BCR-ABL蛋白，可持續(xù)激活并增強(qiáng)胞質(zhì)多種酪氨酸激酶的活性，從而擾亂了細(xì)胞內(nèi)正常的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并啟動(dòng)細(xì)胞增殖和生存的信號(hào)聯(lián)級(jí)反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，BCR-ABL融合基因的水平對(duì)CML患者病情的發(fā)展具有重要影響， 在CML患者疾病分期、療效評(píng)價(jià)、病情預(yù)后判斷等方面具有重要意義[13-14]。

qRT-PCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)物質(zhì)，并通過熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程和產(chǎn)物總量，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)樣品的模版進(jìn)行定量分析的方法。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢(shì)[15-18]：①通過熒光信號(hào)強(qiáng)度的檢測(cè)可以記錄每次循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的總量，有效解決了傳統(tǒng)PCR只能終點(diǎn)進(jìn)行定量檢查的局限;②Ct值的重現(xiàn)性好，Ct值一般設(shè)定在PCR反應(yīng)剛進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期，此時(shí)微小誤差尚未放大，得到的Ct值較為恒定;③模板的Ct值與起始模板的拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量測(cè)定。

RT-PCR于1988年首次應(yīng)用于CML的BCR-ABL融合基因水平檢測(cè)，其準(zhǔn)確性得到臨床廣泛認(rèn)可，我院自2010年已經(jīng)開展包括BCR-ABL融合基因在內(nèi)等白血病相關(guān)項(xiàng)目的檢測(cè)，目前BCR-ABL融合基因水平的監(jiān)測(cè)采用qRT-PCR法，結(jié)果準(zhǔn)確可靠[19-20]。本研究采用qRT-PCR法對(duì)35例CML患者BCR-ABL融合基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，從慢性期到急變期，患者的BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本平不斷升高，可見BCR-ABL融合基因水平與CML患者病情的程度具有明顯相關(guān)性，BCR-ABL融合基因水平越高，患者的病情越重，因此BCR-ABL水平在CML診斷和疾病分期中具有較高的準(zhǔn)確性。通過伊馬替尼治療后，不同BCR-ABL水平組患者的療效和臨床預(yù)后具有明顯差異，其中低水平組和中水平組患者的療效滿意率較高，患者的DFS更長(zhǎng)，而高水平組患者的療效滿意率底，DFS較短，由此可見，BCR-ABL水平與患者的臨床療效和預(yù)后具有明顯相關(guān)性，可有效指導(dǎo)患者治療方案的選擇、評(píng)估患者的治療效果以及預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況。通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者治療前、治療后第3、6、12個(gè)月的外周血BCR-ABL融合基因水平，結(jié)果顯示，經(jīng)過伊馬替尼靶向治療后第6個(gè)月，患者BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本水平明顯低于治療前，其下降幅度前6個(gè)月最為顯著（P<0.05）;本研究中5例患者在伊馬替尼治療后第3個(gè)月后仍然無法達(dá)到CHR，BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本水平>10.00%，通過檢測(cè)其BCR-ABL突變情況，改用合適的酪氨酸激酶抑制劑治療12個(gè)月后，4例患者達(dá)到MMR。因此，在利用伊馬替尼治療CML患者過程中，可通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者外周血BCR-ABL融合基因水平，發(fā)現(xiàn)患者治療第3個(gè)月以后，若其BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本水平≤10.00%，或治療第12個(gè)月時(shí)BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本水平≤1.00%，此時(shí)可維持當(dāng)前伊馬替尼劑量，否則，應(yīng)增加劑量或改用其他合適的酪氨酸激酶抑制，從而更有效地實(shí)現(xiàn)CML患者不同時(shí)期的精準(zhǔn)治療，提高患者的長(zhǎng)期無病生存率。

本研究不足之處：本研究樣本數(shù)較少，僅35例，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可能存在較大誤差，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量，以縮小實(shí)驗(yàn)誤差。

綜上所述，qRT-PCR技術(shù)可準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)患者外周血BCR-ABL融合基因水平，有利于輔助CML患者疾病的診斷和病情分期，在CML的臨床治療中，通過對(duì)CML患者動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CML患者外周血BCR-ABL融合基因水平可及時(shí)、準(zhǔn)確地評(píng)估患者的臨床療效，及時(shí)發(fā)現(xiàn)其病情變化并調(diào)整其治療方案，對(duì)實(shí)現(xiàn)CML患者不同時(shí)期的精準(zhǔn)治療、提高其DFS具有重要作用。

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