李美萍 李蓉 王志娟 張慶 白樺 張生萬 呂慶

摘?要?建立了固相萃取-氣相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測飲用水中16種痕量亞硝胺的方法。水樣經(jīng)固相萃取富集、氮吹定量濃縮后，用DB-35MS色譜柱分離，高分辨質(zhì)譜全掃描模式檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。對色譜分離條件、質(zhì)譜離子源溫度、色譜載氣流速、進(jìn)樣方式以及脈沖壓力等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件為離子源溫度280℃、載氣流速2.0 mL/min、脈沖不分流且脈沖壓力為200 kPa。通過四因素三水平正交實驗得到最佳的固相萃取條件為Chromabond HR-P萃取柱、10 mL乙酸乙酯洗脫。結(jié)果表明，本方法對于不同亞硝胺的線性范圍為0.2～500 μg/L，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9943～0.9997，檢出限（LOD）為0.05～0.5 ng/L，定量限（LOQ）為0.1～1.0 ng/L，遠(yuǎn)低于目前各國的限量水平。4個不同水平的加標(biāo)回收率為72.4%～114.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為0.8%～9.5%。采用本方法對北京地區(qū)的12個實際水樣進(jìn)行測定，有5種亞硝胺被檢出，含量為0.9～20.4 ng/L。本方法靈敏度和準(zhǔn)確度高， 選擇性好， 適用于水中痕量亞硝胺的檢測。

關(guān)鍵詞?亞硝胺; 固相萃取; 氣相色譜; 高分辨質(zhì)譜; 飲用水

1?引 言

亞硝胺是一類具有NNO結(jié)構(gòu)的污染物，迄今為止已發(fā)現(xiàn)的300多種亞硝胺中約有90%具有致癌作用[1]。近年來，在啤酒、熏肉制品、化妝品、煙草和乳膠制品中均檢出亞硝胺，在河水、地下水、污水和飲用水[2，3]中均發(fā)現(xiàn)了亞硝胺的存在。 研究表明，包括二氧化氯、臭氧及氯在內(nèi)的消毒過程，結(jié)合紫外線等， 可能導(dǎo)致亞硝胺含量增加[4]。飲用水中亞硝胺的安全問題逐漸受到重視，國際癌癥研究署（IARC）將N-亞硝基二甲胺（NDMA）和N-亞硝基二乙胺（NDEA）列為2A 類致癌物，將N-亞硝基二丙胺（NDPA）、N-亞硝基甲基乙基胺（NMEA）、N-亞硝基嗎啉（NMOR）、N-亞硝基吡咯（NPYR）、N-亞硝基哌啶（NPIP）和N-亞硝基二丁胺（NDBA）列為2B類致癌物[5]。美國環(huán)境保護(hù)署（EPA）規(guī)定， NDEA、NDMA、NDBA和NPYR水體中的最高容許濃度（致癌風(fēng)險達(dá)到10-5時）分別為2、7、60和200 ng/L[6]; 加利福尼亞州規(guī)定飲用水中NDMA、NDEA和NDPA的限量為10 ng/L[7]; 德國規(guī)定NDMA和NMOR的最大殘留限量為10 ng/L[8]; 加拿大國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定NDMA限值為40 ng/L。我國也亟待出臺飲用水中亞硝胺的限量標(biāo)準(zhǔn)。

由于水中亞硝胺的限量和含量極低，因此預(yù)富集濃縮的前處理步驟必不可少。已報道的液液萃?。↙LE）[9]、固相萃取（SPE）[10]、固相微萃取（SPME）[11]等前處理技術(shù)中，SPE可對大體積水樣進(jìn)行萃取，具有重現(xiàn)性好、濃縮倍數(shù)高等特點，適用于各種類型水體中亞硝胺的萃取，還可根據(jù)水樣類型選擇合適的填料，是水中亞硝胺萃取的主要方法。目前，水中亞硝胺的檢測方法有液相色譜（HPLC）[12]、液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）[3]、氣相色譜（GC）[13]和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）[11，14]等，如我國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HJ 809-2016[15]采用氣相色譜法測定水中的4種亞硝胺。研究表明，采用單純色譜或者低分辨質(zhì)譜檢測的選擇性較差，易與干擾化合物重疊，產(chǎn)生假陽性[16]; 其中電子轟擊電離源（EI源）GC-MS[17]易產(chǎn)生無差別的離子碎片，給甄別干擾物和目標(biāo)物帶來困難，而化學(xué)電離源（CI源）[16]等軟電離方式可產(chǎn)生更多有利于結(jié)構(gòu)確證的分子離子信息。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）[18]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）[19]具有相對較高的選擇性和靈敏度，如美國EPA 521方法[20]采用GC-MS/MS測定飲用水中7種亞硝胺。高分辨質(zhì)譜具有高質(zhì)量分辨率和高質(zhì)量精度（質(zhì)量偏差通?！? ppm），為復(fù)雜樣品基質(zhì)中痕量物質(zhì)的精準(zhǔn)檢測提供了有力的技術(shù)保障，Planas 等[8]曾采用氣相色譜-磁質(zhì)譜（分辨率6000/10000）測定了水中9種亞硝胺。本研究基于SPE結(jié)合氣相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，建立飲用水中16種痕量亞硝胺的檢測方法。本方法具有非常高的靈敏度和準(zhǔn)確度，適用于水中痕量亞硝胺的檢測。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Q Exactive GC Orbitrap型氣相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜儀，配有TriPlus RSH自動進(jìn)樣器（美國Thermo Fisher公司）; 7890N-5977B型氣相色譜-質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）; TurboVap Ⅱ型自動氮吹濃縮儀（美國Biotage 公司）; 固相萃取裝置（美國Supelco公司）; Chromabond Easy、Chromabond HR-P 萃取柱（500 mg，6 mL，德國MN公司）; Supelclean ENVI-Chrom P萃取柱（250 mg，6 mL，美國Supelco公司）。

16種亞硝胺及2種內(nèi)標(biāo)NDMA-d6和NDPA-d14的標(biāo)準(zhǔn)品購自TCI、Sigma、Dr. Ehrenstorfer、Manhage、TRC等供應(yīng)商，純度均大于95%; 正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇（色譜純，美國J.T. Baker公司）; 無水硫酸鈉（分析純，北京化學(xué)試劑有限公司）; 實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)制備的超純水。

2.2?標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取50 mg標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，得到1000 mg/L的單標(biāo)儲備液。用乙酸乙酯配制10 mg/L的16種N-亞硝胺的混合儲備液以及2種內(nèi)標(biāo)混合儲備液，進(jìn)一步配制0.5 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作溶液，于-18℃避光保存。使用時根據(jù)需要用乙酸乙酯稀釋成0.01～500 μg/L的混合工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)NDMA-d6和NDPA-d14的濃度均為50 μg/L。

將10 mg/L的混合儲備液用乙酸乙酯逐級稀釋，配制0.2～500.0 μg/L系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)物濃度為50 μg/L，分別進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3?樣品前處理

在1 L水樣中加入50 μL 0.5 mg/L內(nèi)標(biāo)溶液后混勻靜置。Chromabond HR-P固相萃取柱依次用5 mL甲醇活化、 5 mL水平衡，然后將水樣以3 mL/min流速過柱，上樣完成后，抽干1 min。用10 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，加入無水Na2SO4進(jìn)行脫水，最后將上清液氮吹濃縮至0.5 mL，待測。

2.4?檢測條件

色譜條件：DB-35MS色譜柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）; 載氣為高純氦氣（99.999%）; 進(jìn)樣體積1 μL; 脈沖不分流進(jìn)樣，脈沖壓力200 kPa，脈沖時間1 min; 載氣流速2.0 mL/min; 進(jìn)樣口溫度250℃，傳輸線溫度250℃; 程序升溫：初始溫度為40℃，保持1 min后，以15℃/min速率升至270℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：分辨率60000 FWHM（200 m/z）; EI電離源，離子源溫度280℃; 溶劑延遲3 min; 全掃描模式（Full-Scan），掃描范圍m/z 40～300。16種亞硝胺及2種內(nèi)標(biāo)的定性和定量離子見表1。

3?結(jié)果與討論

3.1?色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

利用低分辨氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)， 考察了弱極性的HP-5MS（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）、中等極性的DB-35MS（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）和DB-624（30 m×0.25 mm， 1.4 μm）、強(qiáng)極性的DB-WAX（30 m × 0.25 mm， 0.25 μm）4種色譜柱對16種亞硝胺的分離情況。色譜柱DB-624和DB-WAX具有較好的分離效果，然而DB-624對于物質(zhì)3、14、15、16的響應(yīng)低，檢測過程中發(fā)現(xiàn)會明顯影響其靈敏度; DB-WAX不能分離6、8兩個物質(zhì)，但這兩種物質(zhì)具有相同的監(jiān)測離子106.065，若不分離，則難以分別檢測; HP-5MS分離效果最差，且物質(zhì)1、14、15響應(yīng)低; DB-35MS對各物質(zhì)的響應(yīng)均較好，對于共流出色譜峰能夠通過提取特征離子將其有效分離，不影響定性和定量分析，且色譜柱熱穩(wěn)定性較好（340℃）。因此選用DB-35MS色譜柱進(jìn)行后續(xù)研究。

Q Exactive-GC質(zhì)譜儀在60000分辨率下全掃描能達(dá)到每秒7張譜圖以上的采集速率，使數(shù)據(jù)獲得足夠多的掃描點數(shù); 同時質(zhì)量誤差在1 ppm以內(nèi)，保證了數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性。歐盟EC/657/2002關(guān)于質(zhì)譜定性要求必須達(dá)到4個確證點（ Identification point，IP），高分辨質(zhì)譜對精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行全掃描測定，每個離子被定義為2個確證點，一個定量離子和一個輔助定性離子的確證點即可達(dá)到4個，從而實現(xiàn)同時定量和定性確證。16種亞硝胺及2種內(nèi)標(biāo)物的定量和輔助定性離子見表1。

為了得到較高的靈敏度，對于質(zhì)譜離子源溫度、色譜載氣流速、進(jìn)樣方式以及脈沖壓力進(jìn)行了優(yōu)化。各物質(zhì)峰面積隨離子源溫度的升高而增大，280℃之后保持相對穩(wěn)定，較高的溫度有利于提高離子化效率及適當(dāng)改善峰拖尾現(xiàn)象。較大的載氣流速有助于提高物質(zhì)的出峰時間，進(jìn)而得到較為尖銳的峰形減少峰拖尾現(xiàn)象，載氣流速2.0 mL/min時大多數(shù)物質(zhì)響應(yīng)值較高。脈沖不分流的效果優(yōu)于不脈沖，這是由于脈沖進(jìn)樣方式在進(jìn)樣口施以較高壓力，使物質(zhì)能快速進(jìn)入色譜柱，減少在進(jìn)樣口的分解及損失，同時有利于得到尖銳對稱的峰形。通過對脈沖壓力進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在200 kPa時達(dá)到最高點，并在之后趨于穩(wěn)定，因此選擇脈沖不分流且脈沖壓力為200 kPa。

3.2?固相萃取條件優(yōu)化

根據(jù)本課題組前期研究及文獻(xiàn)報道[21]，選取填料為苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的3種SPE柱用于正交實驗，分別是Chromabond HR-P、Supelclean ENVI-Chrom P和Chromabond Easy。16種N-亞硝胺的正辛醇-水分配系數(shù)（lgkow）范圍為0.57～3.90，從水溶性到油溶性均有分布，因此選取了3種不同lgkow值的洗脫溶劑，分別是正己烷、乙酸乙酯和丙酮，其中正己烷（3.29）為親油性，乙酸乙酯（0.86）為親油性同時有一定的親水性，丙酮（0.24）為親水性。

選用四因素三水平正交表（L9（34））對固相萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，實驗設(shè)計見表2，考察各實驗條件下萃取亞硝胺含量1 μg/L的100 mL水溶液（換算成待測溶液濃度為200 μg/L）的回收率情況。結(jié)果表明，采用乙酸乙酯作洗脫溶劑時，各亞硝胺的回收率較好，可能因為乙酸乙酯對水溶性和油溶性的目標(biāo)物質(zhì)均能較好地溶解并洗脫。而正己烷的親油性較強(qiáng)，對親水性的亞硝胺如NDMA溶解性較差，導(dǎo)致該物質(zhì)的回收率極差。在9個正交實驗中，實驗2（A1B2C2）的回收率相對較好; 對實驗結(jié)果進(jìn)行極差分析，得到各分析物的最佳固相萃取條件， 除了NDBA， 其它亞硝胺的最佳固相萃取條件都比較一致，只有洗脫量分布在兩個水平上，即8和10 mL。之后進(jìn)行驗證實驗，采用Chromabond HR-P柱，8和10 mL乙酸乙酯，結(jié)果表明，10 mL乙酸乙酯的回收率更好，各物質(zhì)均達(dá)到88%以上。因此，選擇Chromabond HR-P萃取柱進(jìn)行固相萃取， 用10 mL乙酸乙酯洗脫。

3.3?方法學(xué)考察

3.3.1?線性范圍、檢出限及定量限?將不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（含相同濃度的內(nèi)標(biāo)），由低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比 （S/N≥3） 確定16種亞硝胺物質(zhì)的檢出限，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，以S/N≥10得到方法的定量限，結(jié)果如表3所示。實驗結(jié)果表明， 各物質(zhì)在線性范圍

3.3.2?方法回收率及精密度?通過在空白水樣中添加4個不同濃度的亞硝胺混標(biāo)，進(jìn)行6次平行檢測。由表4可知，本方法對于不同物質(zhì)的回收率在72.4%～114.8%之間，RSD（n=6）在0.8%～9.5%之間。

與已報道的水中亞硝胺的檢測方法相比（表5），本方法可檢測的亞硝胺物質(zhì)數(shù)量多（16種）、檢出限低（0.05～0.5 ng/L）、回收率較好，更為關(guān)鍵的是， 通過采用高分辨質(zhì)譜檢測，各物質(zhì)定性和定量離子質(zhì)量誤差均小于1.839 ppm，保證了數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性，且達(dá)到歐盟EC/657/2002規(guī)定的4個確證點，因此在進(jìn)行痕量亞硝胺檢測時，本方法能夠有效排除基質(zhì)干擾，準(zhǔn)確度和靈敏度較高。

3.4?實際水樣分析

應(yīng)用本方法對北京市內(nèi)東城、海淀、朝陽、石景山、通州、大興等不同地區(qū)的12個自來水樣進(jìn)行測定（表6），檢出了5種亞硝胺（NMPhA、NEPhA、NMOR、NDPhA、NDBzA），其中NMOR只在S1（Sample 1）中檢出，為0.9 ng/L，低于德國限量10 ng/L; 而對于檢出的其它亞硝胺，目前尚無限量要求，需要對其進(jìn)行關(guān)注。

4?結(jié) 論

建立了飲用水中16種痕量亞硝胺的固相萃取-氣相色譜高分辨質(zhì)譜檢測方法。在優(yōu)化的儀器檢測條件及固相萃取條件下，16種物質(zhì)的檢出限（LODs）為0.05～0.50 ng/L，遠(yuǎn)低于目前各國的限量水平，同時高分辨質(zhì)譜擁有超高的質(zhì)量精度，各物質(zhì)監(jiān)測離子的質(zhì)量數(shù)精確至0.00001，質(zhì)量誤差小于1.839 ppm， 因此本方法具有非常高的選擇性和準(zhǔn)確度，適用于水中痕量亞硝胺的確證檢測， 也為其它痕量物質(zhì)的檢測提供了借鑒。

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