姚佳烽 姜祝鵬 趙桐 王昊 陳柏 吳洪濤

摘?要?研究了多電極陣列微流控芯片內(nèi)不同細胞在介電泳力下的運動特征，對外部形態(tài)相同而內(nèi)部組蛋白不同的兩種細胞進行了分離。多電極陣列微流控芯片在流道的5個正方形橫截面嵌入電極陣列，每個橫截面的一組對邊嵌入8根電極，此結(jié)構(gòu)擴大了微流道的尺寸，可以實現(xiàn)細胞在介電泳力的作用下高流量分離。為了研究微流控芯片內(nèi)細胞運動特征，首先通過電場數(shù)值分析，對一個橫截面內(nèi)多電極電場分布進行了計算， 得到了最佳電極組合方式，使得電場分布均勻，且介電泳力最大。之后，通過實驗分析了在不同頻率、多電極復(fù)雜電場下，外部形態(tài)相同而內(nèi)部組蛋白不同的人肺部成纖維細胞MRC-5的運動特點。通過對介電泳力的波譜進行分析，得到了野生型（WT）和組蛋白-GFP型（GFP-HT）兩種細胞的分離頻率為f=30 kHz。最后，在兩個入口處通入不同比例的蔗糖（Sucrose）溶液與兩種細胞混合液，計算了細胞的分離率。當兩個入口的流量比為12∶1時，兩種細胞的分離率可以達到93.5%。本研究提出的多電極陣列微流控芯片分離細胞的方法為細胞的高流量快速分離奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?介電泳; 細胞運動; 多電極; 復(fù)合電場; 最優(yōu)電極組合; 微流控芯片

1?引 言

微流控芯片能夠在單個緊湊裝置中實現(xiàn)多種功能，如細胞分離、計數(shù)和裂解分析[1～3]， 目前，有多種微流控芯片可實現(xiàn)細胞分離[4，5]。利用微流體裝置進行免標記高速細胞操作是生物醫(yī)學研究中的重要技術(shù)[7～9]， 常見的免標記分離方法有磁學[10，11]、光學[12]，流體力學[13]、聲學[14]以及電動學技術(shù)[15]?等。在這些技術(shù)中，電動學是最有前景的方法之一，它根據(jù)電學性質(zhì)、細胞形態(tài)及細胞表面積等的差異，從普通細胞中操縱特定細胞[8，16，17]。電動學分離技術(shù)適用于由完全不同的細胞所組成的混合物的細胞操作（如癌細胞和血細胞）。然而，對外部形態(tài)相同，而內(nèi)部組蛋白不同的細胞分離仍存在一些困難。

針對以上問題，研究者開發(fā)出了一種面向細胞免標記檢測與分離的多電極陣列微流控芯片，該芯片可以實現(xiàn)細胞空間內(nèi)的高速分離[18～20]。由于多電極陣列的存在，通過選擇激勵電極的不同組合，可以控制細胞運動的方向和電動力的強度。在介電泳力（Dielectrophoretic force， DEP）、熱浮力和電熱力等交流電動力中，介電泳力作用于不同細胞，產(chǎn)生不同方向的運動，而其它力則作用于流體，產(chǎn)生渦流運動，以推動細胞向電極方向靠近[21]。目前，將多電極陣列微流控芯片應(yīng)用于由外部形態(tài)相同，但細胞內(nèi)組蛋白不同的兩種細胞的高速分離，尚未得到充分研究。

本研究采用已開發(fā)的多電極陣列微流控芯片，首先通過數(shù)值計算，得到了最優(yōu)電極組合方式，以得到均勻的電場分布與最大的介電泳力。針對人肺成纖維細胞 （Medical research council cell strain 5，MRC-5），采用帶負電荷的綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）和帶正電的組蛋白（Histone，HT）改變細胞內(nèi)部的成分，研究了綠色熒光蛋白（GFP）標記的組蛋白-GFP細胞（GFP-HT）與野生型細胞（Wild type， WT）的不同運動。最后，通過實驗方法，對WT和GFP-HT兩種細胞進行了分離。本研究提出的多電極陣列微流控芯片分離細胞的方法， 為高通量分離細胞提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

2??實驗方法

2.1?儀器與試劑

Eclipse LV 100顯微鏡（日本Nikon公司），配備有50倍物鏡（NA=0.55）、Fastcam SA3高速相機（日本Photron公司）。

人成纖維細胞來源的MRC-5 SV1 TG1細胞系（日本RIKEN BioResource Research Center ）; 10%胎牛血清（日本Nacalai Tesque公司）; 青霉素、鏈霉素、低葡萄糖Dulbecco改良伊格爾液（美國GIBCO公司）。

2.2?實驗方法

2.2.1?微流控芯片加工?多電極陣列微流控芯片的制作過程如下：（1）利用光刻法在石英平板上沉積5片10 μm的電極，電極之間間隔為200 μm; （2）在沉積好的電極上再鋪一片石英平板，構(gòu)成一個電極夾層; （3）在鋪好的第二層石英平板上繼續(xù)利用光刻法沉積第二層的5個電極; （4）重復(fù)之前的方法，共沉積4層電極; （5）在石英與電極夾層的結(jié)構(gòu)上開出方形槽，作為流道，即可在流道周圍形成5個橫截面電極。加工方法步驟與文獻[18]類似，但文獻[18]采用菱形結(jié)構(gòu)的微流道，而本研究的微流道是方形結(jié)構(gòu)。

2.2.2?樣品制備?制備通過轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白融合組蛋白修飾的MRC-5人肺成纖維細胞系，以觀察WT細胞系和GFP-HT細胞系細胞內(nèi)電荷變化的效果。GFP-HT質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染程序參照文獻[22]方法。將穩(wěn)定表達GFP融合組蛋白的MRC-5細胞（GFP-HT細胞）和野生型MRC-5細胞（WT細胞）培養(yǎng)在有10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素（分別為50 u/mL和50 μg/mL）的低葡萄糖Dulbecco改良伊格爾液中。在多電極陣列微流控芯片分析細胞運動的實驗中，將細胞用胰蛋白酶消化并重懸于Dulbecco磷酸鹽緩沖液（D-PBS）中，調(diào)整最終密度為1.0 × 106 cell/mL。

2.2.3?實驗過程?為了避免細胞電致穿孔現(xiàn)象，采用了交流電壓輸入，電壓Vpp=20 V，頻率f=10 MHz。 交流電顯著降低了細胞膜內(nèi)外的電勢差，因而避免了細胞電致穿孔現(xiàn)象。在實驗中，在多層電極微流控裝置的主流通道中填充細胞懸浮液后，將AC電壓施加到第一和第三層電極，而第二和第四層電極被設(shè)定為接地。用顯微鏡觀察由于施加電壓引起的細胞顆粒運動。焦平面被設(shè)置為電極的第一層，在施加交流電壓后，以60 fps捕獲圖像。

采用粒子跟蹤測速（PTV）技術(shù)，通過拉格朗日方法在x-z平面跟蹤流體中的單個細胞。x-z平面平行于電極層， x方向垂直于電極，朝向多層電極微流控裝置主流通道的中心區(qū)域。考慮時間變化，計算細胞的速度，比較3種細胞之間的細胞顆粒運動。在對電極施加交流電壓的狀態(tài)下，以0.1 s的時間間隔依次追蹤距離電極（25 ± 5） μm的中心線（z=0）附近的細胞，使用內(nèi)部開發(fā)的圖像分析程序計算細胞的軌跡。

2.3?多電極電場分布計算

本研究討論的交流電場控制方程是麥克斯韋方程組。在電場是角頻率為ω時間諧波，并且沒有相位滯后的情況下，可以使用電場的復(fù)數(shù)表示法=E0exp（jωt），其中電場的相量幅度E0是實數(shù)。對于微電極結(jié)構(gòu)，磁效應(yīng)可以忽略不計[20]。因此，復(fù)雜形式的麥克斯韋方程簡化為：

其中，σ和ε是流體的電導(dǎo)率和介電常數(shù)， ρe是局部電荷密度，u是流體速度。式（1）表明，可采用復(fù)合電勢描述復(fù)合電場，即：

其中，0是電勢的相位幅度。式（2）中的對流項ρeu是可以忽略的，因為在此條件下電雷諾數(shù)估計為Reel=U/（σD）～10111[14]。此外，假設(shè)電導(dǎo)率和介電常數(shù)的空間變化很小，通過應(yīng)用小擾動理論[4]，式（2）和式（3）減小到拉普拉斯方程的電勢，20=0。為了方便描述電動運動的時間平均效應(yīng)，本研究采用復(fù)合場相量幅度的均方根（RMS）場。相應(yīng)地，拉普拉斯方程=02求解，之后，靜電場E=Ε0/2的RMS由式（4）計算：

多電極電壓施加方式分類，其中數(shù)字①②③④代表微流道單側(cè)電極序號。單側(cè)4個電極施加電壓方式分為4類（A、B、C和D）：A（10××）、B（1000）、C（1001）、D（1010）。以A（10××）為例，其含義為，第一個電極加電壓（用1表示），第二個電極接地（用0表示），第三、四個電極空置不使用（用×表示），具體分類見表1。

2.4?正負介電泳（DEP）

為了分離兩種細胞，需要得到不同方向的DEP力。分析產(chǎn)生DEP力的公式，在交流電作用下，介電泳（DEP）力可表示為：

其中，dc是細胞直徑， εf是溶液介電常數(shù)，ω是外加電場的角頻率，Erms是電場強度的均方根。 Re[CM（ω）]是方程（5）中復(fù)數(shù)CM（ω）的實部。

實際材料的介電常數(shù)和電導(dǎo)率僅是在特定頻率下材料的“常數(shù)”，并反映了在該頻率下極化與場強關(guān)系的斜率。通常，介電常數(shù)和電導(dǎo)率是頻率的單調(diào)變化函數(shù)。懸浮體和周圍介質(zhì)之間這些變化的相互作用引起介質(zhì)中物體的凈極化，介質(zhì)在頻率范圍內(nèi)可能具有相當復(fù)雜的形狀。

其中，εc 和εf是細胞和流體的復(fù)介電常數(shù)。式（6）在一定頻率范圍內(nèi)具有正值和負值，就產(chǎn)生了正、負介電泳，即DEP力對于 Re[CM（ω）]的正值是正的，對于Re[CM（ω）]的負值是負的。

單個細胞在流體中運動受力為：

其中， mc為細胞的質(zhì)量，uc為細胞的速度，F(xiàn)D為細胞受到流體的曳力，其表達式為：

3?結(jié)果與討論

3.1?兩類細胞的結(jié)構(gòu)特點

在細胞和分子生物學中，蛋白質(zhì)印跡法是用于鑒定蛋白質(zhì)的重要技術(shù)[23]。根據(jù)顯微鏡觀察和蛋白質(zhì)印跡法對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)成分的鑒定[18]，建立了GFP-HT和WT兩種細胞的示意圖。兩類細胞在相襯圖像和熒光圖像中的觀察結(jié)果如圖3右方所示。相襯圖像表示了細胞的結(jié)構(gòu)，熒光圖像顯示了細胞中GFP的量。從熒光圖像中可以看出，GFP-HT細胞顯示斑點狀結(jié)構(gòu)， 表明對于GFP-HT細胞，GFP僅出現(xiàn)在細胞核中。在本研究中，蛋白質(zhì)印跡法確定了兩種細胞中的蛋白質(zhì)類型與含量，各種蛋白質(zhì)成分含量影響兩種不同細胞的電氣參數(shù)，對細胞分離起到了關(guān)鍵作用[22]。此細胞示意圖為實驗研究中分析細胞介電泳運動提供了基礎(chǔ)。

3.2?細胞懸浮液的電學性質(zhì)

細胞懸浮液的電學參數(shù)決定了介電泳力的正負值，本研究考察了不同細胞懸浮液的電學參數(shù)特點。在f=0～5 MHz時，對比WT、GFP-HT和蔗糖（Sucrose）3種溶液的相對介電常數(shù)。隨著頻率增大，相對介電常數(shù)都下降，這是因為電容成分在高頻下逐漸被導(dǎo)通。由于細胞的導(dǎo)電性比蔗糖大，蔗糖的相對介電常數(shù)值明顯低于兩種細胞懸浮液。3種溶液的相對介電常數(shù)在不同頻率下都存在差別，可以產(chǎn)生不同的介電泳力，不同介電參數(shù)的細胞可以實現(xiàn)分離。為實現(xiàn)細胞分離所需的確切頻率值，以及產(chǎn)生更大介電泳力的多電極如何組合，需要通過仿真與實驗進一步分析。

3.3?多電極電場的計算

本研究采用多電極微流控芯片實現(xiàn)高速細胞分離，施加電流時，不同的電極組合方式會產(chǎn)生不同的電場分布，進而影響細胞分離效果。因此，本研究采用數(shù)值計算尋找最佳的電極組合方式。

多電極陣列微流控芯片一個橫截面內(nèi)不同電極組合的電場分布數(shù)值計算結(jié)果。其中，組合方式B（1000）、C（1001）和D（1010）得到了y方向上較均勻的電場，容易在x方向得到均勻分布的DEP力; 組合方式A（10××）的電場強度主要集中在右上方，無法在整個橫截面上施加DEP力。定量對比了電場強度的大小與分布均勻性， ?組合方式D（1010）中，第1和3根電極施加電流，2和4電極接地， 能夠在y方向上得到相對均勻的電場強度平方的梯度。由式（5）得知，電場強度平方的梯度與DEP力成正比。根據(jù)式（5），此組合方式也可在y方向上產(chǎn)生較大且均勻的DEP力。故選擇組合方式D（1010）為最佳電極組合方式，進行細胞的運動分析。

3.4?不同細胞運動對比分析?按照組合方式D（1010）施加電場后，在不同頻率下分析了野生型（WT）細胞和組蛋白-GFP（GFP-HT）型細胞的運動方向與速度。對于兩種細胞，在施加頻率為f=10 kHz時，運動方向均為遠離電極的方向，表明在此頻率下，兩種細胞均受到負DEP力; 在施加頻率為f ≥ 100 kHz時，運動方向均為靠近電極的方向，表明兩種細胞受到了正DEP力。顏色也表明，越靠近電極，運動速度越大。

能夠同時對兩類細胞產(chǎn)生正與負的DEP力的頻率被稱為分離頻率。為了更加定量化確定細胞運動方向與分離頻率的關(guān)系，對細胞在不同頻率下的Re[CM（ω）]進行了實驗分析。對于WT細胞，在頻率為f=25 kHz時，Re[CM（ω）]=0，說明f=25 kHz是WT細胞產(chǎn)生正負DEP力的分界點; 對于GFP-HT細胞，f=35 kHz時，Re[CM（ω）]=0，說明f=35 kHz是GFP-HT產(chǎn)生正與負的DEP力的分界點。

負的Re[CM（ω）]產(chǎn)生負DEP力，細胞遠離電極運動; 同樣地，正的Re[CM（ω）]產(chǎn)生正DEP力，細胞靠近電極運動。因此基于實驗結(jié)果，可以取f=30 kHz為兩種細胞的分離頻率。

從等效電路的觀點來看，對于一個單細胞，細胞膜具有電容成分，可等價為電容器，細胞質(zhì)及細胞核可等價為電阻。對于兩種類型的細胞，不同的運動最初來自細胞內(nèi)成分中的蛋白質(zhì)量。具有較小介電常數(shù)的組蛋白GFP型細胞在電場作用下表現(xiàn)出較低的極化效應(yīng)，產(chǎn)生不同的Re[CM（ω）]，并對應(yīng)不同方向的DEP力。

3.5?細胞分離應(yīng)用

利用以上分析結(jié)果，對多電極陣列微流控芯片5個橫截面的單側(cè)電極都采用D（1010）類型的電流施加方式，施加f=30 kHz的電流，對兩種細胞WT和GFP-HT進行了分離實驗。在傳統(tǒng)的微流體裝置中，流體動力聚焦是通過多個泵和/或壓力源仔細控制流速實現(xiàn)的。本研究中的分離實驗采用的微流控芯片有3個入口，采用位于兩邊的2個入口可以使細胞運動形成鞘流（Sheath flow），從而縮小了細胞懸浮液流動的區(qū)域，使細胞懸浮液聚焦于一側(cè)電極界面附近，并大大減小了擴散距離。

入口A通入蔗糖溶液，入口B通入WT與GFP-HT兩種細胞混合液。調(diào)整入口A和B的流量，可以調(diào)整細胞混合液的在微流道內(nèi)的濃度。通過檢測出口A和B中兩種細胞的濃度，可以得到細胞分離率。結(jié)果表明，增大入口A的入口流量，可以顯著提高分離率。當入口A與B的流量比為12∶1時，細胞分離率可達到93.5% （表2）。當細胞濃度過大時，細胞間的干涉強烈，不利于WT和GFP-HT兩種細胞的分離。

4?結(jié) 論

利用多電極陣列微流控芯片的特殊結(jié)構(gòu)，在不同頻率、多電極復(fù)雜電場下，研究了外部形態(tài)相同而內(nèi)部組蛋白成分不同的人肺部成纖維細胞MRC-5的運動特點。通過對一個橫截面的電極陣列進行數(shù)值計算，可以發(fā)現(xiàn)，橫截面內(nèi)單側(cè)4個電極交替施加電流時，可以得到均勻的電場分布與最大的介電泳力。進一步通過實驗對MRC-5野生型（WT）與組蛋白-GFP型（GFP-HT）細胞進行了介電泳力的頻譜分析，發(fā)現(xiàn)在多電極電場下兩種細胞的分離頻率為f=30 kHz。細胞分離實驗結(jié)果表明，較小的細胞混合液可以得到較大的分離率， 即當入口A與B的流量比為12∶1時，細胞的分離率可以達到93.5%。 本研究提出的多電極陣列微流控芯片分離細胞的方法為細胞的高流量分離提供了研究基礎(chǔ)。

References

1?Whitesides G M. Nature， 2006， 442（7101）： 368-373

2?LIN Dong-Guo， LIN Jin-Qiong， LI Pei-Wen， YANG Na， XU Bang-Lao， LIU Da-Yu. Chinese J. Anal. Chem.， ?2018， ?46（1）： 113-120

林冬果， 林錦瓊， 李佩文， 楊 娜， 徐邦牢， 劉大漁. 分析化學， 2018， ?46（1）： 113-120

3?Guo J H. Anal. Chem.， ?2016， 88（24）： 11986-11989

4?YANG Li-Jun， ZHU Li， LU Bao-Chun， ZHANG Wei-Yi， Chinese J. Anal. Chem.， ?2017， ?45（6）： 922-930

楊利軍， 朱 麗， 陸寶春， 章維一. 分析化學， ?2017， ?45（6）： 922-930

5?LIN Bing-Cheng. Laboratory on a Microfluidic Chip. Beijing： Science Press， ?2013： ?456-463

林炳承. 微納流控芯片實驗室. ?北京： 科學出版社， 2013： ?456-463

6?Bonner W， Hulett H， Sweet R， Herzenberg L. Rev. Sci. Instrum.， ?1972， ?43（3）： 404-409

7?Zhang J， Yan S， Yuan D， Alici G， Nguyen N T， Warkiani M E， Li W. Lab Chip， ?2016， ?16（1）： 10-34

8?Shim S， Stemke-Hale K， Tsimberidou A M， Noshari J， Anderson T E， Gascoyne P R. Biomicrofluidics， ?2013， ?7（1）： 11807

9?Pethig R. Biomicrofluidics， ?2010， ?4（2）： 022811

10?Yan S， Zhang J， Chen H， Yuan D， Alici G， Du H， Zhu Y， Li W. Biomed. Microdevices， ?2016， ?18（4）： 1-9

11?HUANG Shuang， HE Yong-Qing， JIAO Feng. Chinese J. Anal. Chem.， ?2017， ?45（8）： 1238-1247

黃 爽， 何永清， 焦 鳳. 分析化學， ?2017， ?45（8）： 1238-1247

12?Alvarez N J， Jeppesen C， Yvind K， Mortensen N A， Hassager O. Lab Chip， ?2013， ?13（5）： 928-939

13?Xiang N， Zhang X， Dai Q， Cheng J， Chen K， Ni Z. Lab Chip， ?2016， ?16（14）： 2626-2635

14?Skotis G， Cumming D， Roberts J， Riehle M， Bernassau A. Lab Chip， ?2015， ?15（3）： 802-810

15?Gao J， Sin M L， Liu T， Gau V， Liao J C， Wong P K. Lab Chip， ?2011， ?11（10）： 1770-1775

16?Xiang N， Huang D， Cheng J， Chen K， Zhang X J， Tang W L， Ni Z H. Appl. Phys. Express， ?2016， ?9（2）： 027001

17?Gascoyne P R， Shim S. Cancers （Basel）， ?2014， ?6（1）： 545-579

18?Yao J， Kodera T， Obara H， Sugawara M， Takei M. Biomicrofluidics， ?2015， ?9（4）： 044129

19?Yao J， Obara H， Sapkota A， Takei M. Biomicrofluidics， ?2016， ?10（2）： 024105

20?Yao J， Sugawara M， Obara H， Mizutani T， Takei M. IEEE Trans. Biomed. Circuits Syst.， ?2017， ?11（6）： 1450-1458

21?Haeberle S， Zengerle R. Lab Chip， ?2007， ?7（9）： 1094-1110

22?Mizutani T， Takeda K， Haga H， Todo M， Kawabata K. Histochem. Cell Biol.， ?2014， ?141（5）： 473-481

23?Mahmood T， Yang P C. North Am. J. Med. Sci.， ?2012， ?4（9）： 429-434