葉冠成，陳光耀，江雯欣，徐 甜，王嘉鋮，馬 驍

(1．北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029； 3.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009；4.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069； 5.中日友好醫(yī)院體檢中心，北京 100029)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵蝕性、對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，給患者的生活帶來較大的干擾，并降低患者的生活質(zhì)量[1-2]。其基本的病理改變是滑膜炎和血管炎，常為四肢對稱性多關(guān)節(jié)炎癥。病變慢性期所形成的血管翳具有較強(qiáng)的破壞性，是導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞、畸形和功能障礙的病理基礎(chǔ)。基本的免疫改變則是T、B淋巴細(xì)胞的改變，并且患者血清中類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17, Th17)等免疫因子的表達(dá)亦出現(xiàn)異常[3-4]。良好的RA動物模型作為實(shí)驗(yàn)的前提，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中意義重大。近年來，RA動物模型除了經(jīng)典的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)及佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)模型以外，還有膠原抗體誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen-antibody-induced arthritis，CAIA)模型、降植烷誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(pristante-induced arthritis，PIA)模型、聯(lián)合免疫缺陷小鼠模型、轉(zhuǎn)基因小鼠關(guān)節(jié)炎模型、鏈球菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型和卵蛋白(ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)的家兔關(guān)節(jié)炎模型等，其模型復(fù)制的思路主要在于誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動物的免疫改變。

本病屬于中醫(yī)學(xué)“痹病”“歷節(jié)”和“尪痹”等范疇，發(fā)病原因與風(fēng)、寒、濕邪關(guān)系密切，因此從中醫(yī)學(xué)角度建立的病證結(jié)合模型備受關(guān)注。本研究通過梳理當(dāng)前的文獻(xiàn)資料，對常用的RA模型進(jìn)行綜述。

1 疾病動物模型

1.1 CIA動物模型 CIA模型由Trentham等于1977年最先創(chuàng)建，后來有較多的學(xué)者對其模型復(fù)制方法不斷進(jìn)行補(bǔ)充并使之完善，該方法也是當(dāng)前應(yīng)用較為廣泛的模型復(fù)制方法。即將牛Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ，CⅡ)溶解于乙酸中，再與不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant, IFA)混合至完全乳化，以制備Ⅱ型膠原乳劑，模型復(fù)制時(shí)使用注射器在大鼠背部和尾巴基底部注射二者的混合劑。為加強(qiáng)效果，在初次免疫后第7天和第14天給予加強(qiáng)注射[5-6]。當(dāng)前研究認(rèn)為，實(shí)驗(yàn)動物自身的T和B淋巴細(xì)胞的激活在CIA模型的復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用，疾病的誘導(dǎo)期主要由T細(xì)胞介導(dǎo)，其意義在于支持膠原特異性B細(xì)胞的活化。B細(xì)胞活化后可產(chǎn)生膠原特異性抗體，該抗體可結(jié)合關(guān)節(jié)中膠原蛋白，最終引起免疫復(fù)合物的形成、補(bǔ)體激活和局部炎癥反應(yīng)等免疫與病理變化[7-8]。

為檢測模型質(zhì)量，學(xué)者們從病理與免疫改變等方面對模型進(jìn)行評估。在病理改變上，杜成成等[9]發(fā)現(xiàn)部分大鼠足趾在初次免疫10 d后開始腫脹，14 d后模型復(fù)制基本成功。顯微鏡下見大鼠踝關(guān)節(jié)明顯病變，軟骨組織有增生或增大，軟骨部分細(xì)胞消失或變小，滑膜細(xì)胞與毛細(xì)血管增生，并且間質(zhì)出現(xiàn)水腫，可見炎細(xì)胞浸潤與血管翳。在免疫改變上，鮮瑤瑤等[10]發(fā)現(xiàn)CIA模型大鼠的外周血中Th17細(xì)胞升高，Treg細(xì)胞下降，而Th17與Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的兩種亞型，這與人類RA的免疫學(xué)變化一致，由此體現(xiàn)了CIA模型的核心原理之一在于模擬人體內(nèi)T細(xì)胞的免疫功能失衡狀態(tài)。CIA模型是當(dāng)前應(yīng)用較為廣泛的RA模型，其優(yōu)勢在于模型復(fù)制過程簡便，且與主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)相關(guān)，而MHC在限制性免疫應(yīng)答中意義重大，因而模型動物的關(guān)節(jié)炎病變和免疫學(xué)改變均與人類具有一致性。Alabarse等[11]證實(shí)CIA小鼠表現(xiàn)出與RA患者相似的臨床癥狀，如肌肉質(zhì)量減輕、疲勞加重和虛弱，為此該模型還可很好地模擬RA患者的惡病質(zhì)綜合征，為該病的治療與預(yù)后研究提供更加契合實(shí)情的模型。基于上述優(yōu)點(diǎn)，CIA模型是當(dāng)前公認(rèn)的RA模型，其在免疫研究、新藥研發(fā)、療效評價(jià)等領(lǐng)域?yàn)镽A的相關(guān)研究提供了較大的幫助[12]。但此模型復(fù)制方法不統(tǒng)一，且注射劑量因動物體型不同而差異過大，注射部位也不統(tǒng)一，進(jìn)口的CⅡ試劑價(jià)格過高造成經(jīng)費(fèi)困難，同時(shí)實(shí)驗(yàn)的操作難度上升而可重復(fù)性下降。

1.2 AA動物模型 AA模型又稱弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎，由細(xì)菌學(xué)家Freund創(chuàng)立，是RA動物模型復(fù)制的基本方法之一。模型復(fù)制方法是于實(shí)驗(yàn)動物尾根部皮下注射或足跖皮下注射完全弗氏佐劑(complete Freund’ adjuvant, CFA)，CFA的主要成分為減毒活卡介苗。若效果不理想，則加強(qiáng)免疫一次。AA的模型復(fù)制原理主要是基于卡介苗誘導(dǎo)的分子發(fā)病理論，其來源于65 kDa的抗熱休克蛋白65(heat shock protein 65, HSP65)，HSP65與關(guān)節(jié)滑膜上自身抗原HSP60在保守序列上高度相似，使得兩者可以被同一株T細(xì)胞克隆識別。從而通過結(jié)核桿菌的不斷刺激，造成免疫功能的亢進(jìn)以引起機(jī)體自身的免疫和病理反應(yīng)[13]。

Kumar等[14]發(fā)現(xiàn)，與模型復(fù)制前相比，復(fù)制后第5天起模型組Wistar大鼠體質(zhì)量下降，踝直徑顯著增加，兩只后肢的爪體積顯著增加(P<0.01)。通過病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠滑膜增厚，滑膜間隙減少，出現(xiàn)水腫。水腫和血管損傷導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨亦受損，并有致密的炎癥細(xì)胞浸潤。對于模型復(fù)制是否成功，則以關(guān)節(jié)炎評分和免疫器官指數(shù)等指標(biāo)作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。模型復(fù)制第5天起，模型組大鼠關(guān)節(jié)炎評分逐漸上升，檢測發(fā)現(xiàn)TNF-α增加。TNF-α是炎癥標(biāo)記物，因此其增加的水平表明炎癥和關(guān)節(jié)組織破壞，提示模型復(fù)制成功。本法是一種較為經(jīng)典的模型復(fù)制方法，其優(yōu)勢在于操作簡便，可重復(fù)，試劑易于購買，價(jià)格低廉，模型復(fù)制效果穩(wěn)定，發(fā)病速度快，而且大鼠的免疫和病理改變與人類RA相近，可以較好地模擬發(fā)病的相關(guān)機(jī)制。但AA模型由于發(fā)病較快，且發(fā)病的時(shí)間不統(tǒng)一，導(dǎo)致其不能較好地反映慢性病理過程[15]。此外，其還會出現(xiàn)發(fā)病程度不均勻，模型復(fù)制成功率偏低等問題。若需深入了解RA的病理過程，單純使用AA模型有較大的局限性，還需要結(jié)合其他類型的動物模型綜合考慮。

1.3 OVA誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型 OVA模型由Dumonde和Glynn于1962年首次建立,OVA是一種外源性抗原。此法包括基礎(chǔ)致敏和局部注射兩個(gè)部分，基礎(chǔ)致敏使用OVA生理鹽水在兔肩胛間區(qū)的5個(gè)部位進(jìn)行皮內(nèi)注射，局部注射是指28 d后，在脛骨結(jié)節(jié)最高點(diǎn)與髕骨下緣連線之中點(diǎn)的髕韌帶兩側(cè)，雙膝各注射雞卵清蛋白乳劑以加強(qiáng)免疫[16]。該模型的復(fù)制原理在于通過皮下反復(fù)注射外源性抗原，以促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生大量抗體，使得抗原與抗體在關(guān)節(jié)滑膜上沉積，激活機(jī)體的免疫細(xì)胞與補(bǔ)體系統(tǒng)，并最終產(chǎn)生抗原-抗體-補(bǔ)體免疫復(fù)合物，通過該復(fù)合物可以誘發(fā)關(guān)節(jié)局部的炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹[17]。

曹慶勇等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在注射24 h后家兔即可出現(xiàn)局部皮膚發(fā)紅、腫脹并伴有發(fā)熱，膝關(guān)節(jié)明顯腫脹。2周后家兔關(guān)節(jié)腔中充斥膿液，關(guān)節(jié)滑膜增厚，關(guān)節(jié)腔纖維化，滑膜上皮細(xì)胞增生并伴有炎癥細(xì)胞浸潤。家兔血清IL-1與TNF-α含量上升，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些變化表明模型復(fù)制成功。此法當(dāng)前主要適用于家兔等大型動物，模型復(fù)制成功率高，且無需麻醉。由于乳劑對于抗原的釋放作用緩慢，因此可以不斷地對免疫細(xì)胞產(chǎn)生刺激作用以延長作用時(shí)間，可以更好地模擬慢性病理過程。同時(shí)該模型在免疫學(xué)和病理學(xué)上也較為接近人類RA，如IL-1與TNF-α的增高即是RA患者的常見免疫改變，可用于反映炎癥程度[19]。OVA模型的主要弊端：其對實(shí)驗(yàn)動物的要求較高，多適用于以家兔為代表的大型動物，大鼠和小鼠等小型動物較少使用此法進(jìn)行模型復(fù)制，因而需要較多的經(jīng)費(fèi)支持；模型復(fù)制分為基礎(chǔ)致敏和局部注射兩個(gè)部分，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)時(shí)間過長；兔源抗體稀少，后續(xù)研究困難，故其應(yīng)用也受到限制。

1.4 PIA模型 PIA模型是Potter等在1981年首次創(chuàng)立的，隨后有較多的學(xué)者對PIA模型進(jìn)行了一系列研究。降植烷是2,6,10,14-四甲基十五烷(2,6,10,14-tetramethyl-pentadecan)，為一種單純的烷類化合物，由于該佐劑的非免疫原性，因此它不能被T或B細(xì)胞特異性識別，其造成關(guān)節(jié)炎的原理在于降植烷可以對免疫系統(tǒng)造成非特異性刺激并引起自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞活化，屬于MHC Ⅱ類分子限制的T細(xì)胞依賴性疾病這一范疇[20]。

陶云霞等[21]使用小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在小鼠腹腔內(nèi)注射降植烷，發(fā)現(xiàn)從第18周開始模型組小鼠的關(guān)節(jié)部分出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象，足部腫脹、關(guān)節(jié)增粗，并伴有黏膜紅腫滲出。后足厚度與正常組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病理顯示實(shí)驗(yàn)小鼠骨關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，可見壞死脫落的關(guān)節(jié)軟骨，關(guān)節(jié)腔狹窄，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤。這些變化均提示模型復(fù)制成功。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，模型小鼠的樹突狀細(xì)胞、吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞亞群數(shù)量上升，同時(shí)其T細(xì)胞的表達(dá)也有明顯變化，小鼠脾臟CD4、CD8以及CD154+T細(xì)胞數(shù)量上升，這與RA患者的免疫變化有較多的相似之處。GON?ALVES等[22]發(fā)現(xiàn)，PIA模型在病理上屬于多發(fā)對稱性關(guān)節(jié)炎，與人類相似。在基因?qū)用?，其可以很好地模擬RA相關(guān)基因上調(diào)與下調(diào)情況，并且發(fā)現(xiàn)miR-132-3p是易感小鼠中上調(diào)最多的miRNA，該基因在與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的全身癥狀中發(fā)揮關(guān)鍵作用。同時(shí)，不同的基因可調(diào)控不同的病程階段，因此適于研究人類RA的病理機(jī)制，操作也較為便捷，結(jié)果易于重復(fù)，對實(shí)驗(yàn)動物造成的不適感和對實(shí)驗(yàn)動物的要求也相對較低，因此是一類良好的RA模型[23]。但就目前文獻(xiàn)看，該模型成功率偏低，其對動物與實(shí)驗(yàn)環(huán)境都有較高的要求，且花費(fèi)較多。

2 病證結(jié)合RA動物模型

由于單純西醫(yī)疾病動物模型不能很好地模擬RA與中醫(yī)證候間的關(guān)系，因此在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域，許多學(xué)者在CIA和AA模型的基礎(chǔ)上，根據(jù)中醫(yī)證候的特征，加入中醫(yī)致病因素，模擬RA的中醫(yī)證候進(jìn)行模型復(fù)制。此類模型既能考慮西醫(yī)病因，又具有中醫(yī)特色，在中西醫(yī)結(jié)合研究中發(fā)揮重要的作用。目前，常見的有風(fēng)濕寒阻RA模型、風(fēng)濕熱郁RA模型、脾虛RA模型和腎虛痹證RA模型。

2.1 風(fēng)寒濕痹與風(fēng)濕熱郁RA動物模型 風(fēng)寒與風(fēng)熱之邪是RA發(fā)病的主要外邪，由于風(fēng)性善行而數(shù)變，故其較易侵襲人體薄弱之處，為此復(fù)制風(fēng)寒濕痹與風(fēng)濕熱郁模型是當(dāng)前研究的主要思路。魏艷霞利用SD大鼠，將其置于模型復(fù)制箱中，給予風(fēng)速5 m/s，濕度90%～95%，溫度0 ℃的風(fēng)寒濕刺激14 d。第15天起采用AA模型復(fù)制方法復(fù)制RA模型，繼續(xù)風(fēng)寒濕刺激30 d，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束[24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)接受風(fēng)寒刺激的大鼠足腫脹程度和依據(jù)足腫脹容積進(jìn)行的AI評分均有明顯差異，病理改變亦更加明顯。鎮(zhèn)蘭芳[25]在CIA模型基礎(chǔ)上，每天將大鼠置于人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行風(fēng)濕熱刺激，連續(xù)30 d。人工氣候箱內(nèi)濕度為90%±4%，溫度為(33±2)℃，風(fēng)力3級。模型復(fù)制15 d后出現(xiàn)相應(yīng)癥狀，大鼠萎靡少動，大便稀溏臭穢，符合濕熱之邪停滯證的表現(xiàn)。關(guān)節(jié)炎指數(shù)與正常組相比具有明顯差異，病理發(fā)現(xiàn)滑膜細(xì)胞增生，炎癥細(xì)胞浸潤，提示模型復(fù)制成功。

2.2 瘀血痹阻RA動物模型 瘀血痹阻是RA的常見中醫(yī)證型之一，也是痹證所發(fā)生的主要病機(jī)。RA患者常因血脈瘀阻、血行不暢而表現(xiàn)為關(guān)節(jié)刺痛，痛有定處，皮下見瘀點(diǎn)瘀斑，舌下絡(luò)脈曲張。研究者在西醫(yī)模型復(fù)制的基礎(chǔ)上，復(fù)制瘀血痹阻病證結(jié)合模型。李茜等[26]在CIA模型的基礎(chǔ)上，在大鼠背尾部注射CFA與鹽酸腎上腺素混合溶劑，2 h后將大鼠置于4 ℃冷水中游泳，持續(xù)14 d。觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠活動減少，第4天足趾開始腫脹，舌質(zhì)紫暗或出現(xiàn)瘀點(diǎn)，全血黏度和血漿黏度均高于正常組，其病理和血液流變學(xué)改變與血瘀證以及RA表現(xiàn)具有高度的一致性，提示模型復(fù)制成功。

2.3 腎虛型RA動物模型 腎主骨生髓，而RA的主要病理改變即是關(guān)節(jié)與骨骼的破壞，為此復(fù)制合適的腎虛證動物模型，有助于從中醫(yī)角度研究RA的發(fā)病機(jī)制與藥物療效。陶黎等[27]先切除SD大鼠雙側(cè)卵巢，再復(fù)制腎虛證CIA模型，同時(shí)為了避免手術(shù)因素對模型復(fù)制的影響，設(shè)立假手術(shù)組，即僅切除卵巢周圍的脂肪組織而不切除卵巢。與正常組和假手術(shù)組相比，腎虛組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯高于正常組和假手術(shù)組，且病理變化更為嚴(yán)重，出現(xiàn)大量破骨細(xì)胞，并且血清雌二醇水平降低。這一系列的病理生理改變接近人類RA的相關(guān)特征，即RA的病灶部位出現(xiàn)大量成熟的破骨細(xì)胞，而腎虛通過影響其功能改變骨骼重建。

2.4 脾虛型RA動物模型 脾虛也是RA發(fā)病的常見證候之一。脾主運(yùn)化，脾虛則水濕不運(yùn)而停聚于體內(nèi)，化而為痰，痰濁阻滯于經(jīng)脈骨骼關(guān)節(jié)，發(fā)為痹證。脾又為后天之本，脾虛則正氣不足，不能固護(hù)機(jī)體而易受外邪侵襲，發(fā)為本病。同時(shí)脾虛則水谷精微運(yùn)化不利，脾虛及腎，腎臟失于濡養(yǎng)，日久腎虛。腎者主水，全身水濕泛濫，元?dú)獠蛔悖L(fēng)寒易于侵犯人體，亦發(fā)為本病[28]，故復(fù)制脾虛證動物模型對于本病的研究具有相應(yīng)意義。肖誠等[29]給予大鼠腹腔注射利血平，復(fù)制脾虛證，14 d后再復(fù)制CIA模型。利血平是一種吲哚類生物堿，作用于腎上腺素能神經(jīng)，通過消耗動物體內(nèi)兒茶酚胺，造成自主神經(jīng)功能絕對或相對亢進(jìn)，繼而出現(xiàn)納差、活動少、萎靡不振、腹瀉等與脾虛類似的癥狀。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠出現(xiàn)踝關(guān)節(jié)紅腫，并伴有倦怠乏力、食少便溏。光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)出現(xiàn)血管翳，滑膜組織增生，關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)也遭到明顯的破壞，提示模型復(fù)制成功。

3 展望

RA動物模型的復(fù)制是RA實(shí)驗(yàn)研究的重要環(huán)節(jié)，良好的RA模型需要滿足技術(shù)成熟、方法簡便、成本低廉和成功率高等要求。上述模型中，CIA與AA模型是當(dāng)前最為常用的經(jīng)典模型，其歷史悠久，可復(fù)制程度高，能較好地模擬人類RA的病理狀態(tài)。

單純疾病動物模型不能模擬RA的中醫(yī)證候，而病證結(jié)合動物模型達(dá)到西醫(yī)學(xué)病因和病理變化與中醫(yī)學(xué)證候的有機(jī)結(jié)合。但西醫(yī)的“病”并不等同于中醫(yī)的“證”，中醫(yī)證候復(fù)雜程度較高，因此模型復(fù)制的可靠性與成功率并不穩(wěn)定。中醫(yī)在辨證論治時(shí)講究四診合參，而模型復(fù)制過程中難以對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行準(zhǔn)確地診斷，故明顯降低模型的可靠性。并且在模型復(fù)制過程中給予的刺激可能會增加變證，如給予風(fēng)寒刺激時(shí)，可能也會帶來心膽氣虛的變證，應(yīng)進(jìn)一步研究規(guī)避變證的方法。當(dāng)前所復(fù)制的病證結(jié)合動物模型多數(shù)僅僅實(shí)現(xiàn)了“病”與“證”的疊加，沒有深入研究中醫(yī)證候的具體特點(diǎn)和相關(guān)臨床表現(xiàn)，也沒有從中醫(yī)病因病機(jī)的角度出發(fā)進(jìn)行研究，需要今后繼續(xù)探索。

綜上所述，由于實(shí)驗(yàn)動物與人存在較大的差異，因而當(dāng)前沒有一種模型復(fù)制方法能完全模擬人類的RA狀態(tài)。未來的模型復(fù)制研究中，應(yīng)最大程度地貼近人類的疾病狀態(tài)，深入臨床實(shí)際，探究RA發(fā)病的相關(guān)機(jī)制和臨床癥狀，從病理和免疫等角度加強(qiáng)對模型的評估。可以借助現(xiàn)代的醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，提高觀察的準(zhǔn)確性。還應(yīng)深入研究中醫(yī)證候的內(nèi)涵，從一個(gè)證候所對應(yīng)的病因病機(jī)入手，研究證候的病機(jī)和發(fā)病規(guī)律，同時(shí)契合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病因，做到病證結(jié)合，確保模型復(fù)制的科學(xué)性、規(guī)范性和統(tǒng)一性，探索出符合西醫(yī)病理和中醫(yī)辨證要求的RA模型。