黃 娟，明 露，陳艷芬,2，唐春萍，張玉英，楊超燕

(廣東藥科大學(xué)1.中藥學(xué)院、2.廣州市新藥篩選模型體系構(gòu)建與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、3.生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential channel, TRP)是一類重要的陽離子通道[1]。瞬時(shí)感受器電位離子通道A1即TRPA1，又稱為ANKTMI蛋白，是TRP的成員之一[2]，存在于細(xì)胞膜或胞內(nèi)細(xì)胞器膜上，其蛋白具有14氮-末端，錨定蛋白重復(fù)序列，錨蛋白序列的功能可能是與細(xì)胞內(nèi)的骨架蛋白相互作用，以定位TRPA1在細(xì)胞膜的部分[3]。TRPA1主要分布在背根神經(jīng)節(jié)、迷走神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)等初級(jí)感覺神經(jīng)元上，近年有文獻(xiàn)報(bào)道，在一些非神經(jīng)組織中可能也有表達(dá)[4-5]。TRPA1可以被傷害性冷刺激物激活，也能被一系列化學(xué)刺激激活，比如大蒜、芥子油、異硫氰酸鹽類、丙烯醛等，其激活后，以Ca2+等陽離子進(jìn)入胞內(nèi)和胞內(nèi)細(xì)胞器上相應(yīng)通道開放后釋放等形式，轉(zhuǎn)導(dǎo)外界刺激信號(hào)[6-7]。目前研究表明，TRPA1通道在疼痛(包括神經(jīng)源性疼痛、機(jī)械性疼痛、炎性痛、偏頭痛、牙痛等多種疼痛)、冷覺、聽覺等多種感覺生理功能上都有介導(dǎo)作用，成為當(dāng)今學(xué)術(shù)研究的熱點(diǎn)[8-9]，因此，以TRPA1為治療靶點(diǎn)，開發(fā)特異性調(diào)節(jié)劑有著廣闊的應(yīng)用前景[10-11]。但由于該通道主要表達(dá)在初級(jí)感覺神經(jīng)元，難以獲得高純度和高活度的表達(dá)TRPA1通道的原位細(xì)胞。因此，本研究通過構(gòu)建TRPA1重組真核表達(dá)載體，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建TRPA1離子通道HEK-293T細(xì)胞異源表達(dá)體系，為進(jìn)一步闡明TRPA1信號(hào)通路和分子機(jī)制，以及篩選靶向TRPA1特異性調(diào)節(jié)劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1細(xì)胞、菌株及試劑人胚腎(HEK-293T)細(xì)胞株、大腸桿菌E.coliDH5α菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存；真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)，購自Invitrogen；DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑TRIzol、GoScriptTMReverse Transcription 試劑盒、dNTP、Taq酶及buffer、DNA marker，均為Promega公司產(chǎn)品；pGEM-T Easy T4DNA連接酶、Taq聚合酶、EcoRV、NheI、XbaI及NotI(限制性內(nèi)切酶)、膠回收試劑盒，均為美國MBI公司產(chǎn)品；LipofectamineTM2000試劑盒、G418，均為Invitrogen公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒，上海生工生物有限公司產(chǎn)品；兔多克隆抗體TRPA1(ab68847)，Abcam公司產(chǎn)品；濃縮型SABC(鏈霉親和素-生物素復(fù)合物)試劑盒、DAB顯色試劑盒，均為武漢博士德產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑為市售國產(chǎn)分析純。

1.2儀器PCR儀(德國Whatman公司)；電泳儀(北京市六一儀器廠)；TOCAN領(lǐng)成全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(上海領(lǐng)成生物技術(shù)有限公司)；3-30 K低溫高速離心機(jī)(美國Sigma公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國SHELLAB公司)。

2 方法

2.1TRPA1基因的擴(kuò)增及克隆先用RT-PCR擴(kuò)增1.5 kb和1.9 kb的TRPA1基因片段。兩個(gè)片段的PCR反應(yīng)條件均為：cDNA 1 μL，Buffer 5 μL，dNTP(2 mmol·L-1)5 μL，Mg2+(25 mmol·L-1)3 μL，上、下游引物各1 μL(引物1：Forward primer：5′-GTGCTAGCATGAAGCGCAGCTTGAGGAGG GTTCT-3′,Reverse primer: 5′-AAATCTAGAAGAACTTTCATG CACTCGGG-3′;引物2:Forward primer：5′-GTTCTTCTAGATTT CTGCATGATACCT-3′, Reverse primer: 5′-TGCCTAGGCTAGA TCTGGGTGGCTAATAGAACAATGTGTT-3′)，DOD-Plus Neo 1 μL，ddH2O 33 μL，共計(jì)50 μL。反應(yīng)參數(shù)：98 ℃預(yù)變性3 min，97 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 115 s，擴(kuò)增36個(gè)循環(huán)，最后于72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖膠回收后，與pGEM-T Easy載體進(jìn)行反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用LB營養(yǎng)瓊脂平板(含AMP 50 mg·L-1的抗生素)進(jìn)行培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)好的細(xì)菌培養(yǎng)皿置于4 ℃冰箱中保存6～8 h，使藍(lán)白斑變得更加清晰以便挑取陽性克隆。取經(jīng)初步酶切檢測后純化的質(zhì)粒DNA，送由上海生工公司采用雙向測定法測序。

2.2TRPA1基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定測序確認(rèn)后，用NheI和XbaI酶切消化1.9 kb質(zhì)粒DNA(T-easy-1.9)，XbaI和NotI酶切消化1.5 kb質(zhì)粒DNA(T-easy-1.5)，NheI和NotI酶切消化載體pcDNA3.1(-)DNA，分別膠中純化回收所需要的目的片段。然后T4DNA連接酶16 ℃反應(yīng)3 h，室溫下靜置1 h, 轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸肝菌(步驟同“2.1”), 從含青霉素的LB平板上,挑選陽性克隆，d 2抽提質(zhì)粒DNA，進(jìn)行NotI單酶切和NheI+NotI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)鑒定。

2.3脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞將HEK-293T細(xì)胞用含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，18～24 h待細(xì)胞貼壁后，更換新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，去除培養(yǎng)液，用2 mL的無菌PBS清洗2次，加入1 mL 0.25%的胰酶-EDTA消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化狀態(tài)，如細(xì)胞縮小、變圓、細(xì)胞間的間隙變大后，快速加入2 mL的完全培養(yǎng)基終止消化，在離心機(jī)中以1 000 r·min-1離心4～5 min后，倒掉上清液，加入4～5 mL的完全培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

利用“2.2”方法提取目的基因真核重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-TRPA1)。將融合度90%～95%的HEK-293T細(xì)胞，以6×105每孔的細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，24 h后使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞置于37 ℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后換液，加含濃度為150 mg·L-1G418的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選穩(wěn)定的表達(dá)株，每2 d換液1次，挑選單個(gè)獲得的細(xì)胞單克隆團(tuán)，轉(zhuǎn)移到6孔板繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞TRPA1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的檢測

2.4.1RT-PCR檢測基因的轉(zhuǎn)錄 選取G418篩選出來的單克隆細(xì)胞株，用TRIzol試劑提取總RNA，同時(shí)提取非轉(zhuǎn)染的HEK293-T細(xì)胞總RNA作為對(duì)照。根據(jù)TRPA1基因的序列設(shè)計(jì)引物，TRPA1上游引物: 5′-AACCGCATAGAGCTCCTCAA-3′，下游引物：5′-GAGGAATAAGGGCAACACGA-3′，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、PCR，最后PCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖中進(jìn)行電泳檢測。

2.4.2免疫組化檢測蛋白的表達(dá) 在滅菌的培養(yǎng)皿中鋪上玻片，用于細(xì)胞爬片。在爬片上滴加細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其貼壁。24 h后取出培養(yǎng)皿，PBS漂洗后，用4%多聚甲醛在室溫下固定20 min，PBS漂洗，再加入0.25% Txiton，于37 ℃恒溫箱孵育15 min，PBS漂洗；加入3% H2O2處理，室溫15 min，PBS漂洗；加入血清封閉液，在37 ℃條件下處理30 min；甩干封閉液，加入一抗(1 ∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，陰性對(duì)照用PBS代替一抗；再加入二抗，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育40 min，PBS漂洗；滴加SABC適量，于37 ℃濕盒內(nèi)孵育40 min，PBS漂洗；加DAB試劑進(jìn)行顯色處理，鏡下掌握顯色程度；最后復(fù)染，脫水，透明，封片。

3 結(jié)果

3.1TRPA1基因的RT-PCR擴(kuò)增以前期提取的cDNA為模板，分別用特異性引物PCR擴(kuò)增TRPA 1的基因片段。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分別獲得大約1.9 kb和1.5 kb的目的基因片段(Fig 1)，與預(yù)計(jì)結(jié)果相符。

Fig 1 Detection of RT-PCR amplification products

1: DNA marker; 2: 1.9 kb PCR products; 3: 1.5 kb PCR products.

3.2T-easy-1.9和T-easy-1.5重組克隆質(zhì)粒的酶切鑒定與測序?qū)RPA1基因片段分別克隆到T-easy克隆載體，從含青霉素的LB 平板上，挑取陽性克隆，T-easy-1.9重組克隆質(zhì)粒計(jì)經(jīng)Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切鑒定，T-easy-1.5重組克隆質(zhì)粒經(jīng)Not Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切鑒定，與預(yù)計(jì)結(jié)果相符，初步推測T-easy-1.9重組克隆質(zhì)粒和T-easy-1.5重組克隆質(zhì)粒克隆正確，基因片段已經(jīng)克隆到T-easy載體。酶切檢測后純化的重組質(zhì)粒DNA送由上海生工公司，采用雙向測定法測序，與TRPA1基因庫的序列一致。

3.3TRPA1真核重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定將膠回收純化的目的基因片段與表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，從含青霉素的LB平板上，挑選陽性克隆，抽提重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-TRPA1，經(jīng)NotI單酶切片段為8.4 kb，Nhe Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切片段大小為5 kb和3.4 kb(Fig 2)，結(jié)果和預(yù)測一致。

3.4TRPA1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的RT-PCR及免疫組化檢測結(jié)果將篩選得到的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染TRPA1的HEK293-T細(xì)胞可檢測到TRPA1基因的轉(zhuǎn)錄，而非轉(zhuǎn)染的HEK293-T細(xì)胞則沒有TRPA1基因的轉(zhuǎn)錄(Fig 3)。

細(xì)胞爬片固定后，進(jìn)行免疫組化檢測，以未轉(zhuǎn)染TRPA1質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞作為陰性對(duì)照。Fig 4結(jié)果顯示，沒有轉(zhuǎn)染TRPA1質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞胞質(zhì)及膜上沒有散在黃色物質(zhì)，結(jié)果為陰性，而轉(zhuǎn)染TRPA1質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞胞質(zhì)及膜上有散在黃色物質(zhì)，結(jié)果呈陽性表達(dá)，提示有TRPA1蛋白表達(dá)。

Fig 2 Restriction enzyme digestion of pcDNA3.1-TRPA1 recombinant expression plasmid

1: DNA marker; 2: NotI mono-enzyme digestion of pcDNA3.1-TRPA1; 3: Nhe Ⅰ and Not Ⅰ double-enzyme digestion of pcDNA3.1-TRPA1.

Fig 3 RT-PCR detection of TRPA1 transcription

1: Control of HEK-293T cells; 2: Stable expression of TRPA1 HEK-293T cells.

Fig 4 Expression of TRPA1 channel protein in HEK293T cells(×400)

A:Control of HEK-293T cells; B: Stable expression of TRPA1 HEK-293T cells.

4 討論

2003年，Story等[2]首先報(bào)道了ANKTM1(TRPA1)是一種冷敏離子通道，接著Bautista等[12]用基因敲除法證明TRPA1在疼痛中的主導(dǎo)作用，自此TRPA1的激動(dòng)劑與拮抗劑是醫(yī)藥領(lǐng)域近十年一直追逐的研究熱點(diǎn)[13-14]。但是，由于TRPA1通道主要分布在三叉神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)等感覺神經(jīng)元中，分離過程繁瑣，原代培養(yǎng)條件比較苛刻，表達(dá)不夠穩(wěn)定，不太適合于廣泛的藥物篩選和作用機(jī)制研究，且國內(nèi)的研究報(bào)道也比較缺乏。因此，本研究擬通過基因轉(zhuǎn)染的方法，建立一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)TRPA1通道的細(xì)胞模型，為后續(xù)進(jìn)一步探索TRPA1通道的功能研究奠定基礎(chǔ)。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是通過脂質(zhì)雙分子層所構(gòu)成的囊狀載體，包裹外源基因與細(xì)胞膜融合內(nèi)吞而完成外源基因?qū)氲囊环N生物學(xué)方法，此方法操作簡單，且對(duì)細(xì)胞的毒性較低[15]。由于TRPA1基因片段較長，本研究分2個(gè)片段進(jìn)行構(gòu)建，選擇合適的酶切位點(diǎn)，依次連接的構(gòu)建策略。研究結(jié)果顯示，使用T-easy克隆載體，含有氨芐青霉素抗性的編碼基因和LacZ′編碼基因，可根據(jù)氨芐抗性和α-互補(bǔ)原理，經(jīng)藍(lán)白篩選，挑出白色菌落，獲得重組克隆載體。利用酶切和基因測序等方法對(duì)重組克隆載體進(jìn)行鑒定，結(jié)果與預(yù)測一致。其次，重組表達(dá)載體的構(gòu)建，本研究采用pcDNA3.1表達(dá)載體，含有巨細(xì)胞病毒強(qiáng)啟動(dòng)子(pCWV)序列，確保目的基因的高表達(dá)。最后，在模型鑒定方面，本研究將篩選得到的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行了RT-PCR和免疫組化檢測，證實(shí)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK-293T細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)TRPA1基因，并且在后續(xù)的研究中利用該細(xì)胞模型進(jìn)行了TRPA1的功能研究及藥物篩選研究。