易劍敏，岳 維，高 盼，張偉男

(山西醫(yī)科大學(xué) 1. 麻醉系、2. 第二醫(yī)院麻醉科, 山西 太原 030001)

相關(guān)資料顯示，大約50%的糖尿病患者伴發(fā)明顯的糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)，出現(xiàn)癥狀早，且病情隱匿不易發(fā)現(xiàn)。DPN易累及心臟感覺神經(jīng)，引起神經(jīng)纖維的變性，從而導(dǎo)致神經(jīng)纖維進行性缺失和再生[1]。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor ，NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中重要的一員，通過作用于高親和力酪氨酸激酶A(tyrosine kinase A，TrkA)受體和低親和力p75受體(75 kd neurotrophin receptor, p75NTR)，調(diào)控中樞及周圍神經(jīng)的生長、發(fā)育及再生[2]。糖尿病心臟感覺神經(jīng)病變可引起NGF表達下調(diào)，使受NGF調(diào)控的基因表達產(chǎn)物降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide， CGRP)大幅度減少，從而導(dǎo)致心臟感覺神經(jīng)病變、心肌細胞凋亡和心功能不全[3]。CGRP分布于心血管組織中，具有舒血管作用，保護心肌細胞和內(nèi)皮細胞，調(diào)節(jié)心功能[4]。重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)具有安全性好、免疫源性低、轉(zhuǎn)染時間長等特點，其中rAAV9有較好的心臟親和力，能夠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到大鼠的心肌組織[5-6]。已有實驗證明，外源性補充NGF可以營養(yǎng)正常的神經(jīng)纖維，促進損傷神經(jīng)纖維的修復(fù)再生，改善糖尿病導(dǎo)致的心臟神經(jīng)病變，減少心肌細胞的凋亡，提高心功能[7]。課題組前期研究表明，糖尿病可使NGF表達減少。由此設(shè)想能否通過心肌轉(zhuǎn)染技術(shù)，使NGF在大鼠心肌組織中過表達，本研究探討能否通過心肌點注射的方法，利用rAAV9-NGF基因轉(zhuǎn)染糖尿病大鼠的心臟，上調(diào)NGF的表達，由此產(chǎn)生對糖尿病大鼠心臟損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康♂SD大鼠32只，體質(zhì)量200～250 g，7～8周齡，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物許可證：SCXK(京)2014-0013)。大鼠按隨機數(shù)字表法分為4組(n=8)：對照組(control組)、糖尿病手術(shù)組(D+P組)、糖尿病手術(shù)對照組(D+V組)、糖尿病轉(zhuǎn)染組(D+NGF組)。實驗操作程序經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2試劑與儀器rAAV9-NGF-GFP(滴度1.2×1015vg·L-1)、rAAV9-GFP(滴度1.6×1015vg·L-1)，均購自上海漢恒生物科技有限公司；鏈脲佐菌素(streptozotin，STZ，美國Sigma公司)；大鼠NGF ELISA試劑盒、大鼠CGRP ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；NGF抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gene product 9.5，PGP9.5)抗體(美國Novus公司)；CGRP抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；Alexa Fluor 594羊抗小鼠熒光二抗(美國Invitrogen公司)。小動物生命指標檢測儀(四川儀器廠)；Leica CM-1850恒冷切片機(德國Leica公司)；BX-51型熒光顯微鏡(日本TKO光學(xué)儀器株式會社)；Novapath酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.11型糖尿病模型的制備 大鼠適應(yīng)1周后，D+P組、D+V組、D+NGF組大鼠禁食24 h，繼以腹腔注射STZ(50 mg·kg-1)。連續(xù)測量之后7 d的空腹血糖，以7次血糖值均>16.7 mmol·L-1為1型糖尿病造模成功。

1.3.2測定大鼠甩尾反射潛伏期 STZ注射前1 d及以后每周，使用小動物甩尾儀紅外光源(光照強度40 mW·cm-2，最大刺激時間30 s)對準大鼠尾尖端進行照射，記錄熱痛刺激逃避性甩尾反射潛伏期。

1.3.3病毒轉(zhuǎn)染 大鼠糖尿病成模后第4周，以質(zhì)量分數(shù)為7%的水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，測血糖、體質(zhì)量，經(jīng)口直視下氣管插管，連接呼吸機，并控制呼吸(潮氣量=10 ml·kg-1，通氣頻率=70次每分鐘，吸呼比= 1 ∶2)。將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺，在胸骨體偏左側(cè)1 cm處備皮消毒，暴露上皮組織，鈍性分離胸壁組織直至肋骨，用血管鉗從心尖搏動最強處進入胸腔并擴張，使心尖部暴露于視野。參考并已改良的實驗方法[8]，選取心尖部為注射區(qū)域，網(wǎng)格狀選取5個注射點(點間隔約1 mm，深度1～2 mm)，以前端針頭被90°掰彎的胰島素注射針，注射磷酸緩沖鹽濃液(phosphate buffer saline，PBS)或滴度為0.8×1015vg·L-1的rAAV9-GFP、rAAV9-NGF-GFP各100 μL(每注射點20 μL),逐層關(guān)胸。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射慶大霉素1萬單位以預(yù)防感染。

1.3.4心功能指標的監(jiān)測 轉(zhuǎn)染后第5周(糖尿病造模后9周)，大鼠以質(zhì)量分數(shù)為25%的烏拉坦(5 ml·kg-1)腹腔麻醉，測血糖、體質(zhì)量。連接小動物生命指標檢測儀，監(jiān)測大鼠心電圖，分離大鼠右側(cè)頸動脈，置動脈導(dǎo)管監(jiān)測左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure, LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、心率(heart rate, HR)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)等指標。

1.3.5心肌組織NGF、CGRP含量測定 取左心室處心肌組織，在液氮條件下研磨至粉末狀，按10 ml·g-1加入蛋白裂解液，冰盒裂解1 h(每10 min混勻1次)后，4 ℃、15 000×g離心30 min，取上清，嚴格按照說明書步驟，采用ELISA試劑盒測定樣本NGF、CGRP含量。

1.3.6免疫熒光法測NGF、CGRP及神經(jīng)纖維的表達 造模后第7周和第9周，取大鼠心臟，質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定，濃度梯度的蔗糖脫水，OCT包埋，最后冰凍切片機切片(厚度10 μm)。切片室溫平衡30min，放入0.1%的Triton-100(用PBS 1 ∶1 000稀釋)中，4 ℃冰箱內(nèi)孵育10 min，后以PBS洗5 min×3次；滴加5%牛血清蛋白(BSA)封閉，室溫孵育2 h；滴加以5% BSA稀釋的一抗NGF(1 ∶200)、PGP9.5(1 ∶300)、CGRP(1 ∶500)，4 ℃冰箱孵育過夜；將切片從冰箱取出，室溫平衡10 min，以PBS洗5 min×3次；滴加5% BSA稀釋的熒光標記的二抗(1 ∶1 000)，室溫避光孵育2 h,以PBS洗5 min×3次；甘油封片；熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1大鼠生存狀況D+P組、D+V組、D+NGF組均有1只大鼠死亡，大鼠死亡率組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2大鼠甩尾反射潛伏期如Fig 1所示，與對照組相比，第4周后，其余3組的大鼠甩尾潛伏期均明顯延長(P<0.05)。

Fig 1 Difference in tail-flick latency of rats between each group n=6)*P<0.05 vs control group

2.3大鼠心臟免疫熒光觀察結(jié)果因rAAV9-NGF自身攜帶GFP標簽，故可借助免疫熒光技術(shù)驗證外源基因NGF是否穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入心臟組織中。如Fig 2所示，第9周時，D+V組和D+NGF組有大量的GFP蛋白散在分布于細胞內(nèi)，表明病毒已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；而第7周時卻未見GFP蛋白的表達，rAAV9-NGF未穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

如Fig 3所示，第7周時，與對照組相比，D+P組、D+V組和D+NGF組大鼠心肌處的NGF、CGRP和神經(jīng)纖維特異性標記物免疫熒光減弱，但D+P組、D+V組和D+NGF組3組間無明顯差異。如Fig 4所示，第9周時，CGRP免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維多見于心外膜和心肌層，尤其是血管周圍和血管內(nèi)皮處。D+P組和D+V組大鼠心肌處的NGF、CGRP和神經(jīng)纖維特異性標記物PGP9.5比對照組和D+NGF組明顯減少，而對照組與D+NGF組無明顯差異。

Fig 2 Expression of GFP in group D+V and D+NGF (×20)

At the ninth week, GFP could be seen clearly in group D+V and D+NGF.

2.4各組左心室心肌組織中NGF、CGRP的變化Tab 1結(jié)果顯示，對照組心肌組織中NGF、CGRP含量明顯高于D+P組和D+V組(P<0.05)，提示糖尿病會導(dǎo)致心肌組織的NGF、CGRP表達下降。但D+NGF組的NGF、CGRP的含量卻明顯高于D+P組與D+V組(P<0.05)。對照組與D+NGF組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Tab 1 Expression of NGF, CGRP in rat myocardium of each group n=6)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsgroup D+P;△P<0.05vsgroup D+V

2.5各組心功能指標的變化Tab 2結(jié)果顯示，對照組的LVSP、LVEDP、HR、+dP/dtmax、-dP/dtmax明顯高于D+P組和D+V組(P<0.05)，提示糖尿病大鼠的心功能明顯減弱。但D+NGF組的LVSP、LVEDP、HR、+dP/dtmax、-dP/dtmax卻明顯高于D+P組和D+V組(P<0.05)。對照組與D+NGF組間無差異。

3 討論

DPN是一種由多病因引起的以血糖增高為特征的代謝性疾病，由于胰島素缺乏和血脂異常等因素相互作用，影響感覺、運動和自主神經(jīng)纖維，尤其是極易影響心臟的感覺神經(jīng)，從而導(dǎo)致軸突萎縮、再生潛能減弱、發(fā)炎及纖維進行性喪失[9]。NGF廣泛分布于周圍組織、中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)，不僅能營養(yǎng)神經(jīng)元，而且能促進突觸生長，是介于神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)之間的一種介質(zhì)，對大腦的發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)的生長、損傷神經(jīng)的再生和功能恢復(fù)具有決定性的作用[2]。糖尿病心臟感覺神經(jīng)病變發(fā)病機制包括缺血性微血管病變、NGF及其受體的缺乏、晚期糖基化終末產(chǎn)物的過度產(chǎn)生、氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂、遺傳易感性等，其中NGF及其受體的缺乏是一個極其重要的因素[10]。NGF的表達下調(diào)后，可使受其調(diào)節(jié)的神經(jīng)肽CGRP減少，使心臟感覺神經(jīng)纖維進行性缺失和異常再生，心肌細胞凋亡，心功能惡化[3]。研究證明，采用外源性的NGF治療心臟感覺神經(jīng)病變后，糖尿病導(dǎo)致的心臟感覺神經(jīng)變性得到改善[11]。

Fig 3 Expression of NGF, CGRP and PGP9.5 in myocardium at 7th week (×40)

Fig 4 Expression of NGF, CGRP and PGP9.5 in myocardium at 9th week (×40)

Compared with group D+P and group D+V, the red fluorescence could be seen clearly in control group and group D+NGF.

Tab 2 Difference in cardiac function of rats in each group n=7)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsgroup D+P;△P<0.05vsgroup D+V

基因治療為糖尿病心臟感覺神經(jīng)病變開創(chuàng)了新的治療途徑。本研究采用腹腔注射STZ建立糖尿病模型，利用心肌點注射轉(zhuǎn)染rAAV9-NGF基因至心肌組織上。結(jié)果表明，注射STZ后，大鼠出現(xiàn)熱痛閾值升高，甩尾潛伏期延長，并隨著病程的進展而更加明顯。由于構(gòu)建的病毒需要至少3周，才可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入心肌組織，因此，NGF基因轉(zhuǎn)染后第2周(注射STZ后第6周)時并未見明顯的GFP的表達，第5周(注射STZ后第9周)時可以看到明顯的GFP表達，表明rAAV9-NGF構(gòu)建成功且感染心肌組織，免疫熒光結(jié)果顯示，心肌組織中，尤其是心外膜邊界處和血管周圍的NGF、CGRP和神經(jīng)纖維分布增多。糖尿病大鼠心肌組織中NGF、CGRP蛋白的表達明顯上調(diào)，心功能得到改善。

已有研究證實，心臟感覺神經(jīng)元損傷時，NGF可與TrkA結(jié)合，導(dǎo)致自身酪氨酸殘基磷酸化，逆轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，產(chǎn)生多種信號分子，并將信號傳遞到細胞核，調(diào)控細胞基因的表達，如CGRP，發(fā)揮生物效應(yīng)，從而維持受損神經(jīng)元的存活和分化，決定軸突生長方向，促進受損神經(jīng)修復(fù)，誘導(dǎo)突觸延伸[12]。CGRP具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，可以加強心肌收縮力，增加心輸出量，提高灌注壓，加快心率，降低血液黏稠度，改善心肌血管血流性質(zhì)[4]。因此，本實驗采用心肌點注射轉(zhuǎn)染的方法，將rAAV9-NGF原位導(dǎo)入心臟組織中，使NGF過表達。前期研究表明，過表達的NGF通過選擇性地結(jié)合TrkA和p75NTR，活化cAMP/Ras反應(yīng)元件，然后持續(xù)激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路ERK，進而上調(diào)CGRP的表達[13]。CGRP與其受體結(jié)合后，激活鳥苷酸環(huán)化酶，促進細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷和前列腺素的釋放，發(fā)揮強大的舒血管作用[4]，進而產(chǎn)生對心血管系統(tǒng)保護作用。

由此可以證實，rAAV9-NGF可以轉(zhuǎn)染到糖尿病大鼠心肌組織中，且穩(wěn)定表達，營養(yǎng)神經(jīng)纖維，促進神經(jīng)纖維的再分布，上調(diào)CGRP的表達，部分改善心功能，產(chǎn)生心臟保護作用。為臨床有效地控制DPN，尤其是心臟的感覺神經(jīng)病變，提供了新的治療思路。