鄭曉輝，黃家福，徐淑娟，李 鑫，許雅蘋，房純正，翁樂(lè)斌，汪 潔，黃黎月

(1. 廈門醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)教研室，機(jī)能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361023；2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科,福建 福州 350001；3. 廈門醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)教研室,福建 廈門 361023)

黏附調(diào)節(jié)分子1(adhesion regulating molecule 1, ADRM1)亦被稱為 hRpnl3(human Rpn13)。ADRM1基因位于20號(hào)染色體長(zhǎng)臂13區(qū)(20q13)上，包含9個(gè)外顯子，可轉(zhuǎn)錄成兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，編碼同一種蛋白ADRM1。研究者在對(duì)多細(xì)胞真核生物內(nèi)ADRM1的保守性分析中發(fā)現(xiàn)ADRM1高度保守，說(shuō)明 ADRM1可能在生命過(guò)程中發(fā)揮重要功能[1-2]。研究顯示，ADRM1蛋白是26S蛋白酶體亞單位19S調(diào)節(jié)顆粒上一個(gè)受體[3-4]，決定26S蛋白酶體結(jié)構(gòu)不對(duì)稱性[5]。它分為3個(gè)功能性區(qū)域：N-端、C-端和插入片段。ADRM1通過(guò)N-端結(jié)合到19S調(diào)節(jié)顆粒的Rpn2和Rpn10亞基上，而通過(guò)C-端尾9個(gè)α螺旋與泛素羧端水解酶37(ubiquitin carboxy-terminal hydrolase 37, UCH37)上卷曲螺旋的C-端相互作用，募集UCH37到蛋白酶體上，并將其活化，形成 ADRM1/UCH37復(fù)合物，進(jìn)入蛋白酶體泛素化路徑，介導(dǎo)NF-κB、TGF-β I型受體、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)等底物蛋白的降解[6-8]。

已有研究表明[9-12]，ADRM1在結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、膀胱癌、卵巢癌、肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤中處于過(guò)表達(dá)狀態(tài)，是驅(qū)動(dòng)20ql3區(qū)基因高拷貝擴(kuò)增的主要基因。本實(shí)驗(yàn)組前期研究發(fā)現(xiàn)，ADRM1基因在裸鼠體內(nèi)不同致瘤率HL60細(xì)胞內(nèi)存在表達(dá)差異(≥2倍)，在急性白血病(acute leukemia, AL)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)了解ADRM1在實(shí)驗(yàn)室白血病細(xì)胞株中表達(dá)；其次，觀察ADRM1干擾后HL60細(xì)胞增殖變化；最后，鑒于蛋白酶體抑制劑是臨床多發(fā)性骨髓瘤(multiple yeloma, MM)常用藥，效果明顯；MG132(結(jié)構(gòu)見(jiàn)Fig 1)也稱Z-LLL-CHO、Z-Leu-Leu-Leu-CHO、Z-Leu-Leu-Leu-al或Carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal，是一種常用的蛋白酶體抑制劑，可抑制泛素蛋白酶體途徑活性，上調(diào)caspase-3表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡[14]，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察HL60、NB4細(xì)胞在不同濃度MG132作用下增殖與凋亡，同時(shí)檢測(cè)HL60細(xì)胞內(nèi)ADRM1、UCH37蛋白表達(dá)，了解ADRM1在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標(biāo)本 AL患者初治骨髓標(biāo)本(AL-untreated)、AL患者完全緩解骨髓標(biāo)本(AL-complete remission, AL-CR)、臍帶血標(biāo)本來(lái)自2010年9月至2014年5月期間，福州協(xié)和醫(yī)院門診和住院收治患者。確診根據(jù)FAB分型及張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。以上樣本經(jīng)患者書面知情同意獲得，并經(jīng)中華醫(yī)德委員會(huì)和福建醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合醫(yī)院信托基金批準(zhǔn)使用。

Fig 1 Chemical structure of MG132

1.1.2細(xì)胞株 人急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞NB4、人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP1、人B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞 Ball、人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat、人急性淋巴母細(xì)胞性白血病細(xì)胞Molt-4、人慢性髓系白血病細(xì)胞K562、人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266、人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞U937，由福建省血液病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；人急性粒細(xì)胞白血病部分分化型細(xì)胞 HL60，購(gòu)自上海富衡細(xì)胞公司；大腸桿菌E.coli DH5α、293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3試劑 人淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)；TRIzol reagent(Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)；Oligo Primers(上海生工)；SYBR Green Master(ROX)(Roche公司)；酶切酶、連接酶(NEB)；質(zhì)粒抽提試劑盒(碧云天)；MG132(Sigma)；CCK-8(Yeasen)；Annexin V FLUOS Staining Kit(Roche)；Western blot 抗體(CST公司)；CD34+抗體(BD)。

1.1.4儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱2323-2(SHELLAB公司)；倒置顯微鏡37XA(上海光學(xué)儀器廠)；流式細(xì)胞分選儀FACS Aria(美國(guó)BD 公司)；熒光倒置顯微鏡DMLB(德國(guó)徠卡公司)；Gene Amp 2400 PCR 擴(kuò)增儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；流式細(xì)胞儀EPICSXL(貝克曼庫(kù)爾特公司)；電泳儀PowerPac HC(Bio-Rad公司)；快速Westrn blot儀器MA01821(Millipore)。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR法檢測(cè)CD34+AL細(xì)胞、造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)、AL-CR標(biāo)本、血液腫瘤細(xì)胞株內(nèi)ADRM1 mRNA表達(dá) TRIzol抽提細(xì)胞內(nèi)RNA，于1%瓊脂糖電泳分離，EB染色,在紫外光透射儀中觀察，拍照28 S RNA和18 S RNA ，確定其比值。當(dāng)28 S/18 S約為2 ∶1時(shí)，說(shuō)明RNA穩(wěn)定并且無(wú)降解，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA，用于實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司及上海生工公司合成，引物序列如下：ADRM1上游引物5′-AAGCGGAAAGGGCTGGTGTA-3′，下游引物5′-GCAATGCTCCTCATCCTGGT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度240 bp；以β-actin為對(duì)照基因，其上游引物5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAA-3′，下游引物5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度220 bp。

1.2.2構(gòu)建ADRM1 shRNA與scrambled shRNA慢病毒感染HL60細(xì)胞 利用DNAMAN軟件，與上海吉瑪公司(Genepharma)共同設(shè)計(jì)并合成有效siRNA干擾序列3條及陰性對(duì)照序列1條，利用Lipofectamine 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞，qRT-PCR法篩選最有效干擾序列。上海吉?jiǎng)P公司合成靶序列(ADRM1-shRNA)及陰性對(duì)照序列(scrambled shRNA)相應(yīng)各1對(duì)單鏈DNA，退火合成雙鏈 shDNA，經(jīng)酶切連接到帶GFP篩選標(biāo)記的慢病毒干擾載體GV115上，之后通過(guò)CaCl2沉淀法轉(zhuǎn)導(dǎo)到感受態(tài)DH5α內(nèi)，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，之后質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定后，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，得到ADRM1 shRNA與scrambled shRNA慢病毒干擾載體。由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司包裝成ADRM1 shRNA與scrambled shRNA慢病毒，并進(jìn)行病毒滴度濃縮。慢病毒感染HL60細(xì)胞，流式細(xì)胞分選儀分選GFP陽(yáng)性HL60細(xì)胞，多次流式篩選，得到穩(wěn)定ADRM1 shRNA與scrambled shRNA HL60細(xì)胞株。

1.2.3細(xì)胞增殖/毒性實(shí)驗(yàn) 在96孔板中接種100 μL 細(xì)胞懸液(細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)5×107·L-1；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)1×108·L-1)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h；向培養(yǎng)板加入10 μL不同濃度的MG132，孵育24、48、72 h后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h；用酶標(biāo)儀測(cè)定在450/630 nm處的吸光度。

1.2.4Annexin V FLUOS Staining Kit流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用 Annexin V FLUOS Staining Kit檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集細(xì)胞于5 mL PBS中，800 r·min-1離心5 min， 棄上清，預(yù)冷的PBS洗2次，之后按說(shuō)明書操作。

1.2.5Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，PBS洗2次，加入RIPA細(xì)胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF、1 mmol·L-1正釩酸鈉、10 mg·L-1抑肽酶)提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取40 μg總蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。10% SDS-PAGE電泳后，行轉(zhuǎn)膜印跡，分別用β-actin、ADRM1、UCH37一抗體與膜上的抗原結(jié)合，然后用HRP偶聯(lián)的二抗與其反應(yīng)，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)，經(jīng)壓片曝光后，顯影和定影。比較各組蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1ADRM1mRNA在血液腫瘤細(xì)胞株的表達(dá)以急性白血病完全緩解患者骨髓標(biāo)本(AL-CR)、臍帶血干細(xì)胞標(biāo)本(HSCs)為對(duì)照，結(jié)果如Fig 2所示：急性白血病初治患者骨髓標(biāo)本(AL-untreated)、急性白血病初治患者骨髓 CD34+細(xì)胞標(biāo)本(CD34+AL cells)、急性髓系白血病細(xì)胞株(NB4、THP1、HL60)、急性淋系白血病細(xì)胞株(Ball、Molt-4、Jurkat)、慢性髓系白血病細(xì)胞(K562)、組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞 U937與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞(U266)內(nèi)，ADRM1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)；實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞株內(nèi)ADRM1表達(dá)普遍高于急性白血病初治患者骨髓標(biāo)本內(nèi) ADRM1 表達(dá)。

Fig 2 Comparison of expression of ADRM1 mRNA in blood tumor cell lines

RQ=2-ΔΔCT

2.2qRT-PCR篩選有效靶序列qRT-PCR法檢測(cè)siRNA瞬轉(zhuǎn)后，HL60細(xì)胞內(nèi)ADRM1 mRNA表達(dá)水平，以分析不同靶序列siRNA的干擾有效性。HL60細(xì)胞RNAi 48 h后，β-actin與ADRM1基因的qRT-PCR結(jié)果見(jiàn)Tab 1。353靶點(diǎn)siRNA沉默有效率約0.67(有效率=1-2-ΔΔCT)，1044靶點(diǎn)siRNA則為0.49，所以選擇353靶點(diǎn)siRNA設(shè)計(jì)shRNA。

Tab 1 Expression of ADRM1 mRNA in HL60 after transient transfection of siRNA 48 h(2-ΔΔCT)

2.3成功構(gòu)建慢病毒干擾載體LV-ADRM1-shRNA載體：TGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTG ACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGT TTTAAAATTATGTTTTAAATGGACTATCATATGCTTA CCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATA TATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGGGTCTAC GTGCTGAAGTTCACTCGAGTGAACTTCAGCACGTAG ACCCTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGT GGATAACCGTATTACCGCCAGGCATTAGTTATTAAT AGTAATCAATTAGGGGGTCATTAGTTCATAGCCCAT ATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTAACGGAAAATG GCCCGCCTGGCTGATCGCCCAACGACCCCCGCTCAT TGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGGAACGC CAATAGGCCCTTTCCATTGGGGTCAATGGGTGGAGT ATTTACGGGTAAACTGCC；LV-scrambled-shRNA載體：GGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTG TT CTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGC TTGGATTTCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACG AAGTTATAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAA CTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATAT CCCTTGGAGAAAAGCCTTGTTTTTCTCCGAACGTGT CACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTT TTTCTCGAGTACTAGGATCCACGCGAATTAATTCTG TGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCA GGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCA TCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCC AGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGC ATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAA CTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGC CCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAA。

2.4成功構(gòu)建ADRM1shRNA與scrambledshRNAHL60細(xì)胞由上海吉?jiǎng)P公司包裝慢病毒及滴度測(cè)定。慢病毒感染HL60細(xì)胞，MOI值為病毒滴度/接種細(xì)胞數(shù)。慢病毒感染有效率受MOI值、細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞接種密度、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、培養(yǎng)條件、有無(wú)助轉(zhuǎn)劑及其濃度的影響。我們?cè)趦?yōu)化HL60細(xì)胞感染條件后，采用不同 MOI值，GFP表達(dá)效率也不同，兩者之間不呈正比(Tab 2)；普遍認(rèn)為GFP表達(dá)效率與慢病毒感染有效率呈正相關(guān)。

Tab 2 Effective rate of lentivirus infection in different MOI values

慢病毒對(duì)細(xì)胞也有一定的毒性作用，所以我們以MOI小于75的病毒量感染HL60細(xì)胞(Fig 3)，再采用流式細(xì)胞分選儀分選出GFP陽(yáng)性細(xì)胞，即為慢病毒成功感染的HL60細(xì)胞。分選時(shí)分析觀察10 000個(gè)細(xì)胞，首先以側(cè)向光散射(side scatter，SSC)和前向光散射(forward scatter，F(xiàn)SC)設(shè)門。去除死細(xì)胞，圈選大小比較均一的活細(xì)胞群設(shè)門為P1；P1門內(nèi)細(xì)胞以SSC和GFP再設(shè)門。以野生株HL60細(xì)胞(parental)為對(duì)照，其P1內(nèi)細(xì)胞為GFP陰性，不分群，設(shè)門為P2(Fig 4B)。慢病毒感染的HL60細(xì)胞，P1內(nèi)細(xì)胞分兩群(Fig 4D)，P2門外右為GFP陽(yáng)性細(xì)胞，圈選該GFP陽(yáng)性細(xì)胞群并設(shè)門為P3。P3內(nèi)細(xì)胞即為慢病毒成功感染的HL60細(xì)胞。我們收集該P(yáng)3細(xì)胞群。

Fig 3 Detection of lentivirus infection in HL60 cells(MOI=75,×100)

The photo on the left side is under the ordinary light microscope, while the right side under the fluorescence microscope. A, B: Scrambled shRNA;C,D:ADRM1 shRNA.

Fig 4 Sorting of GFP positive HL60 cells

A,B:Parental HL60 cells;C,D:HL60 cells infected with lentivirus carrying GFP fluorescence

2.5ADRM1shRNA、scrambledshRNA、parentalHL60細(xì)胞內(nèi)ADRM1蛋白的表達(dá)Fig 5的Western blot結(jié)果顯示，ADRM1 shRNA組細(xì)胞內(nèi)ADRM1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)；scrambled shRNA和parental HL60細(xì)胞內(nèi)ADRM1蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯差異。提示成功構(gòu)建ADRM1干擾HL60細(xì)胞及其陰性對(duì)照株。

Fig 5 Expression of ADRM1 protein in ADRM1 shRNA, scrambled shRNA and parental HL60 cells

2.6ADRM1干擾前后HL60細(xì)胞增殖情況CCK-8法檢測(cè)parental、scrambled shRNA和 ADRM1 shRNA各組細(xì)胞增殖情況。如Fig 6所示，ADRM1 shRNA組細(xì)胞增殖緩慢，說(shuō)明下調(diào)ADRM1抑制HL60細(xì)胞增殖。

2.7MG132對(duì)HL60細(xì)胞活力的影響CCK-8法檢測(cè)蛋白酶體抑制劑 MG132(0、0.1、0.25、0.5、0.8、1、1.5 μmol·L-1)作用24 h，對(duì) parental、scrambled shRNA和ADRM1 shRNA HL60細(xì)胞的影響。如Fig 7所示，MG132抑制parental、scrambled shRNA和ADRM1 shRNA HL60 細(xì)胞活力，隨著MG132濃度提高各組細(xì)胞死亡增加；各組細(xì)胞在OD 450/630值相近(即0.15左右)，所需的MG132濃度分別為0.5 μmol·L-1(parental組)、0.8 μmol·L-1(scrambled shRNA組)和1.5 μmol·L-1(ADRM1 shRNA組)，說(shuō)明ADRM1下調(diào)前HL60細(xì)胞對(duì)MG132敏感性較高，反映MG132對(duì)HL60細(xì)胞的毒性作用與HL60細(xì)胞內(nèi)ADRM1蛋白水平相關(guān)。

Fig 6 Cell growth of parental, scrambled shRNA

Fig 7 Cell viability of parental, scrambled shRNA and ADRM1 shRNA groups treated with different MG132 concentrations for 24 h

2.8MG132對(duì)HL60細(xì)胞內(nèi)ADRM1、UCH37蛋白表達(dá)的影響為探討蛋白酶體抑制劑 MG132抑制細(xì)胞增殖、降低其活力的作用與ADRM1的相關(guān)性，利用Western blot檢測(cè) 0.25、0.4 μmol·L-1MG132作用24 h后，parental、scrambled shRNA和ADRM1 shRNA組細(xì)胞內(nèi)ADRM1、UCH37蛋白表達(dá)變化。如Fig 8所示，0.4 μmol·L-1MG132作用24 h后，parental 和scrambled shRNA組細(xì)胞內(nèi)ADRM1、UCH37蛋白表達(dá)減少；ADRM1 shRNA組ADRM1 蛋白表達(dá)提高，UCH37蛋白下調(diào)。0.25 μmol·L-1MG132作用下的parental HL60細(xì)胞UCH37 蛋白表達(dá)提高。0.4 μmol·L-1MG132作用后，ADRM1 shRNA組細(xì)胞ADRM1蛋白表達(dá)提高，0.25 μmol·L-1MG132作用下，parental組細(xì)胞UCH37蛋白表達(dá)提高，可能是各組細(xì)胞對(duì)低濃度MG132應(yīng)激性反應(yīng)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.9MG132促進(jìn)HL60、NB4細(xì)胞凋亡細(xì)胞以1×105·L-1接種6孔板2 mL，設(shè)不同濃度 MG132實(shí)驗(yàn)組，各組2個(gè)復(fù)孔，24 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。圖左上(upper left, UL)為死亡細(xì)胞，右上(upper right, UR)為晚期凋亡細(xì)胞，左下(lower left, LL)為活細(xì)胞，右下(lower right, LR)為早期凋亡細(xì)胞。如Fig 9、10所示，隨著MG132 濃度提高，細(xì)胞早期與晚期凋亡均增加。以MG132濃度為0.4 mol·L-1時(shí)HL60凋亡率為參照，當(dāng)MG132濃度為0.8 μmol·L-1時(shí)HL60細(xì)胞早期凋亡變化較小，晚期凋亡大量增加；而MG132濃度為2 μmol·L-1時(shí)NB4細(xì)胞凋亡率，處于HL60細(xì)胞MG132濃度為0.25 μmol·L-1與0.4 μmol·L-1之間。以上結(jié)果說(shuō)明NB4細(xì)胞對(duì)MG132敏感性小于HL60細(xì)胞，提示不同白血病亞型細(xì)胞株對(duì) MG132藥物反應(yīng)存在個(gè)體差異。

3 討論

ADRM1 mRNA在9株實(shí)驗(yàn)室血液腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，這與前述研究ADRM1在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)情況一致，說(shuō)明ADRM1可能參與血液腫瘤，特別是AL的發(fā)生發(fā)展。

ADRM1干擾前后HL60細(xì)胞在0.5 μmol·L-1MG132作用下，parental組活力下調(diào)72%，scrambled shRNA組下調(diào)42%，而ADRM1 shRNA組下調(diào)30%，提示ADRM1表達(dá)高的腫瘤細(xì)胞對(duì)MG132敏感，受抑制明顯；隨著 MG132濃度提高，HL60細(xì)胞增殖緩慢、活力下降，此時(shí)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)ADRM1、UCH37蛋白表達(dá)減少，說(shuō)明MG132下調(diào)ADRM1、UCH37蛋白表達(dá)，抑制HL60細(xì)胞增殖與活力；HL60、NB4細(xì)胞隨MG132濃度提高凋亡亦明顯增加。以上研究為臨床治療AML采用抑制ADRM1表達(dá)手段提供了理論基礎(chǔ)。

*P<0.05vsparental 0 group;#P<0.05vsscrambled shRNA 0 group;ΔP<0.05vsADRM1 shRNA 0 group

特定基因的mRNA豐度不一定與其翻譯產(chǎn)物——蛋白質(zhì)的表達(dá)量成線性關(guān)系，因?yàn)榛虮磉_(dá)成蛋白的調(diào)控層次包括轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯水平調(diào)控及翻譯后調(diào)控。此外，mRNA的降解、蛋白的降解、修飾折疊等因素都可能導(dǎo)致mRNA豐度與蛋白表達(dá)水平不一致。因此，可以出現(xiàn)ADRM1 mRNA水平較HL60高的NB4細(xì)胞凋亡所需MG132濃度較高的現(xiàn)象。

惡性腫瘤細(xì)胞具有自主生長(zhǎng)、過(guò)度增殖、對(duì)抑制生長(zhǎng)的調(diào)控信號(hào)不敏感、逃避細(xì)胞內(nèi)在的凋亡信號(hào)、促血管生成、侵襲性生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的能力。惡性腫瘤的發(fā)生往往是單克隆腫瘤細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻的結(jié)果。已有研究表明，ADRM1通過(guò)募集UCH37形成ADRM1/UCH37復(fù)合物，介導(dǎo)NF-κB的降解，并影響其活性，參與細(xì)胞周期和凋亡過(guò)程。這提示ADRM1在腫瘤中作用的發(fā)揮可能與UCH37及NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。UCH37可通過(guò)影響B(tài)ax/Bcl-2比率和caspase-9、 caspase-3酶活性而抑制細(xì)胞凋亡。NF-κB與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程有著極為緊密的關(guān)系，對(duì)絕大多數(shù)惡性腫瘤具有促癌作用。靜息狀態(tài)的細(xì)胞，NF-κB位于胞質(zhì)中，與IκB形成復(fù)合物。當(dāng)該復(fù)合物被激活時(shí)，NF-κB暴露核定位位點(diǎn)，進(jìn)入核內(nèi)與特異性κB序列結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。NF-κB主要調(diào)節(jié)炎癥和自身免疫反應(yīng)，也可調(diào)控細(xì)胞周期及凋亡，影響細(xì)胞分化，可控制細(xì)胞增殖及癌變。研究表明，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)與Cydin D1的啟動(dòng)子κB 位點(diǎn)結(jié)合而啟動(dòng)該基因的轉(zhuǎn)錄，也可通過(guò)其他途徑間接上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)。亦有研究顯示，NF-κB可通過(guò)激活Cyclin D2、Cyclin D3、Cyclin E和c-myc的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化和增殖。NF-κB通路的異常激活，可導(dǎo)致一系列細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因的異常表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其增殖。因此，ADRM1可能通過(guò)UCH37改變Bax/Bcl-2比率和caspase-9、caspase-3酶活性，抑制HL60細(xì)胞凋亡；也可能通過(guò)ADRM1/UCH37復(fù)合物影響NF-κB的降解或活性，促進(jìn)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期加速通過(guò)G0/G1期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而在白血病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。因此，本研究為臨床治療AML采用下調(diào)ADRM1表達(dá)策略提供了依據(jù)[4-6,8,14-15]。

Fig 9 Apoptosis of HL60 cells treated with different concentrations of MG132 for 24

A,B, C, D: Apoptosis of HL60 cells exposure to 0, 0.25, 0.4 and 0.8 μmol·L-1MG132 for 24 h; E:Early and late apoptotic rate of HL60 cells.*P<0.05vs0 group

Fig 10 Apoptosis of NB4 cells treated with different concentrations of MG132 for 24

A, B, C, D: Apoptosis of NB4 cells exposed to 0, 0.5, 1 and 2 μmol·L-1MG132 for 24 h; E:Early and late apoptotic rate of NB4 cells.*P<0.05vs0 group