陳 坤,卜淑芳,劉喜燦

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)多見于老年人，俗稱老年性癡呆,其主要臨床癥狀為認知障礙和記憶能力損傷等，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病[1]。隨著人口老齡化的加劇，阿爾茨海默病嚴重危害了老年人的生命健康，患病率隨著年齡的增加而升高[2]，目前全世界阿爾茨海默病患者已超過2400萬人。由于阿爾茨海默病的病因復(fù)雜，當前的治療手段效果并不理想。兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol O-methyl-transferase，COMT)是一種參與兒茶酚雌激素代謝反應(yīng)的關(guān)鍵酶，對雌激素導(dǎo)致的DNA損傷具有保護作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶可編碼兩條不同的mRNAs：可溶性的COMT(S-COMT)和膜結(jié)合型COMT(MB-COMT)[4]。研究證實，COMT在腫瘤組織中高表達，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌和子宮內(nèi)膜癌等[5]。COMT作為一種參與兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)滅活的主要降解酶，與去腎上腺素和多巴胺的代謝密切相關(guān)[6]。因此，研究COMT 酶學活性對神經(jīng)性疾病的治療具有重要意義。因此，本研究通過腦立體定位儀向SD大鼠海馬CA1區(qū)注射Aβ25-35，建立阿爾茨海默病大鼠模型，探究腦脊液和海馬組織兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶與阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶功能的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 實驗動物：健康雄性SD老年大鼠(18～20個月)40只，體重為400～600 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。生長溫度為(23±2)℃，環(huán)境濕度為45%～50%，光照時間為每天12 h，自由進食、進水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。主要試劑：BCA 蛋白濃度測定試劑盒及ECL發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；COMT抗體和β-actin抗體均購自Abcom公司；其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及給藥 選取40只健康雄性SD老年大鼠(18～20個月齡)，隨機分為假手術(shù)(Sham)組和阿爾茨海默病模型(Model)組，每組20只。經(jīng)腦立體定位儀向SD大鼠海馬CA1區(qū)注射Aβ25-35，建立阿爾茨海默病大鼠模型。模型建立具體操作步驟：將SD大鼠進行腹腔麻醉后，固定在腦立體定位儀上。根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》，確定大鼠腦部海馬CA1區(qū)位置，并在兩側(cè)海馬區(qū)各注射1 μl的Aβ25-35，假手術(shù)組注射等量的生理鹽水。注射結(jié)束后，對大鼠腦部進行縫合。

1.2.2 行為學觀察 本實驗采用電刺激逃避即跳臺法對大鼠的行為學進行觀察。大鼠的學習記憶功能的觀察指標為實驗過程中各個大鼠出現(xiàn)的錯誤反應(yīng)次數(shù)和潛伏期。(1)實驗裝置：跳臺裝置為 120 cm×80 cm×24 cm 的有機玻璃箱，刺激電極為箱底鋪的銅柵。將箱子平均分為5格，大鼠回避電擊的安全臺為每格內(nèi)分別放置的高8.5 cm，直徑10.5 cm 的橡膠墊;(2)實驗過程：將大鼠放入試驗箱內(nèi)適應(yīng)5 min，以36 V交流電對鼠進行電擊。大鼠在遭電擊后逃上橡膠墊，再從橡膠墊上跳下，以雙足接觸銅柵遭到電擊為錯誤反應(yīng)次數(shù)一次。首先，對大鼠進行3 min的訓(xùn)練，并記錄錯誤反應(yīng)次數(shù)。24 h后再進行測驗。實驗方法同上，以大鼠首次從橡膠墊跳下時開始計時，作為大鼠觸電潛伏期，并以大鼠第一次和第二次測試過程中出現(xiàn)的錯誤次數(shù)作為學習記憶功能的觀察指標。

1.2.3 qPCR法檢測各組大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的基因表達 實驗結(jié)束后，對各組大鼠進行斷頭處死，并分離出腦部腦脊液和海馬組織。采用組織勻漿機分別對腦脊液和海馬組織進行充分研磨。采用Trizol提取法提取血管中的總RNA，按照Micro RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μl：1 μl總RNA，4 μl 5×Reaction Mix，2 μl 10×Super Script Enzyme Mix，加入雙蒸水將體系補足至20 μl，混勻后離心。反應(yīng)條件為：37 ℃下60 min，95 ℃下5 min，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩０凑誵-PCR試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)錄擴增，反應(yīng)體系為20 μl。使用SYBR Green染料法進行測定，每個樣本設(shè)置4個復(fù)孔。按照試劑盒說明書的反應(yīng)條件進行擴增。基因的相對表達量用2-△△CT法進行計算。

1.2.4 Western blot法檢測各組大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的蛋白表達 各組大鼠在實驗結(jié)束后進行斷頭處死，迅速分離出大鼠大腦腦脊液和海馬組織，并保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｌ崛〗M織蛋白，采用Western blot檢測腦脊液和海馬組織中COMT的蛋白表達水平。分別將大鼠的腦脊液和大腦海馬組織置于研缽中，加入一定體積的蛋白裂解液對組織進行充分研磨，于冰上裂解30 min后，在4 ℃下、12 000×g離心10 min，吸取上清液，并使用BCA蛋白濃度試劑盒對其進行蛋白定量。選取5%的濃縮膠和10%的分離膠，取20 μl蛋白樣品進行上樣，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用10%的脫脂乳粉溶液進行封閉2 h后，一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜。使用TBST洗膜3次，每次15 min，二抗(1∶4000)室溫孵育2 h，用TBST洗膜3次。使用化學發(fā)光法對蛋白進行顯色。

2 結(jié) 果

2.1 阿爾茨海默病對大鼠的逃避行為潛伏期影響 與假手術(shù)組比較，阿爾茨海默病模型組大鼠的潛伏期明顯縮短(P<0.01)，說明阿爾茨海默病對大鼠的逃避行為潛伏期有著消極的影響(見表1)。

2.2 阿爾茨海默病對大鼠的學習記憶錯誤次數(shù)影響 阿爾茨海默病模型組大鼠錯誤(4.87±1.87)次顯著增加(P<0.01)，說明阿爾茨海默病嚴重損害了大鼠的學習記憶功能(見表1)。

2.3 各組大鼠腦脊液中COMT的mRNA表達情況 實時定量PCR(q-PCR)測定結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，阿爾茨海默病模型組大鼠腦脊液中COMT的mRNA表達量均顯著升高(P<0.01)，說明阿爾茨海默病可提高大鼠腦脊液中COMT的mRNA表達量(見表1)。

2.4 各組大鼠海馬組織中COMT的mRNA表達情況 實時定量PCR(q-PCR)測定結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，阿爾茨海默病模型組大鼠海馬組織中COMT的mRNA表達量均顯著升高(P<0.01)，說明阿爾茨海默病可提高大鼠海馬組織中COMT的mRNA表達量(見表1)。

2.5 各組大鼠腦脊液中COMT的蛋白表達情況 Western blot測定結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，阿爾茨海默病模型組大鼠腦脊液中COMT的蛋白表達量顯著上調(diào)(P<0.01)，說明阿爾茨海默病可上調(diào)大鼠腦脊液中COMT的蛋白表達量，這與mRNA的表達結(jié)果相一致(見表1、圖1)。

2.6 各組大鼠海馬組織中COMT的蛋白表達情況 Western blot測定結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，阿爾茨海默病模型組大鼠海馬組織中COMT的蛋白表達量顯著上調(diào)(P<0.01)，說明阿爾茨海默病可上調(diào)大鼠海馬組織中COMT的蛋白表達量，這與mRNA的表達結(jié)果相一致(見表1、圖2)。

表1 Model組和Sham 組大鼠的各項指標比較

圖1 各組大鼠腦脊液中COMT的蛋白表達情況

圖2 各組大鼠海馬組織中COMT的蛋白表達情況

3 討 論

阿爾茨海默病是一種原發(fā)性的退行性腦部疾病，其發(fā)病機制尚不明確，推測可能與基因突變、家族遺傳、神經(jīng)遞質(zhì)及生化改變、免疫功能紊亂、神經(jīng)生長營養(yǎng)因子缺失、鋁中毒、能量代謝降低以及激素水平下降等因素有關(guān)[7]。當前的學者們提出了多種關(guān)于阿爾茨海默病的發(fā)病機制學說，包括膽堿能缺陷學說、β淀粉樣蛋白級聯(lián)學說、tau蛋白異常磷酸化學和氧化應(yīng)激學說等[8]。臨床上治療阿爾茨海默病的藥物主要有抗氧化劑、膽堿酯酶抑制劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗炎藥物和興奮性氨基酸等，但療效并不理想[9]。因此，探究阿爾茨海默病的發(fā)病機制，對其治療具有重要的意義。在阿爾茨海默病的發(fā)病早期，Aβ 沉積是發(fā)病的主要臨床表現(xiàn)和病理變化[10]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠海馬區(qū)的Aβ 沉積可對突觸傳遞和LTP造成破壞，并損傷大鼠的學習記憶功能[11]。Aβ生成過多和Aβ清除障礙是導(dǎo)致Aβ在AD患者腦內(nèi)大量沉積的主要原因。研究證實，在小鼠腦內(nèi)注射Aβ，可導(dǎo)致腦內(nèi)海馬神經(jīng)元大量凋亡[12]。因此，本研究經(jīng)腦立體定位儀向SD大鼠海馬CA1區(qū)注射Aβ25-35，建立阿爾茨海默病大鼠模型，探究大鼠腦脊液和海馬組織中的兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶與阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶功能的相關(guān)性。

學習記憶功能主要分為獲得、鞏固和再現(xiàn)3個階段，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要高級功能[13]。電刺激逃避主要用于評價動物的學習記憶功能，大鼠錯誤反應(yīng)次數(shù)和潛伏期能夠客觀反映出動物的認知過程，具有操作簡便、記錄數(shù)據(jù)準確等優(yōu)點[14]。因此，電刺激逃避法已經(jīng)廣泛于學習記憶功能的檢測。阿爾茨海默病的臨床表現(xiàn)主要為學習記憶功能的減退，因此，本研究測定了大鼠的學習記憶功能。有本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病模型組大鼠的潛伏期顯著縮短，錯誤次數(shù)顯著增加，發(fā)生了明顯的學習記憶功能障礙，阿爾茨海默病嚴重損害了大鼠的學習記憶功能。

兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)廣泛表達于哺乳動物的多種組織中，主要分為膜分泌型和膜結(jié)合型兩種形式[15]。近年來的研究證實，COMT基因與多種腫瘤疾病的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)，并在腫瘤組織中高表達，如子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等[16]。此外，COMT也廣泛分布于神經(jīng)組織，主要生理功能是使多巴胺等兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)失活，其機制是將甲基供體上的甲基轉(zhuǎn)移到兒茶酚胺的3位和4位羥基上。COMT可降解60%位于人類前額葉皮質(zhì)的多巴胺。研究發(fā)現(xiàn)，大腦控制性皮質(zhì)損傷后，COMT的表達持續(xù)增高，并與行動遲緩和認知功能失常有關(guān)[17]。本研究通過實時定量PCR法測定了大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的mRNA表達量，結(jié)果顯示阿爾茨海默病模型組大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的mRNA表達量均顯著高于假手術(shù)組，說明阿爾茨海默病可提高大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的mRNA表達量。同時，本研究還通過Western blot測定了大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的蛋白表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病模型組大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的蛋白表達量顯著高于假手術(shù)組，說明阿爾茨海默病可上調(diào)大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的蛋白表達量，這與mRNA的表達結(jié)果相一致。

綜上所述，阿爾茨海默病可嚴重損傷大鼠的學習記憶功能，并且首次揭示了COMT在AD大鼠腦脊液和海馬組織中mRNA和蛋白的高表達，證實腦脊液和海馬組織兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶的高表達與阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶功能具有顯著相關(guān)性。這將為阿爾茨海默病的發(fā)病機制和治療提供一定的理論依據(jù)。