程 雪，羅玉敏，閔連秋，王 剛

缺血性腦卒中是一系列腦血管疾病導(dǎo)致死亡或嚴(yán)重的損傷，正在尋找廣泛的治療措施。其中一個(gè)潛在的治療手段就是缺血后適應(yīng)，它的神經(jīng)保護(hù)被廣泛的證實(shí)和認(rèn)可，是目前發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)烈的內(nèi)源性缺血保護(hù)措施，缺血后適應(yīng)是在缺血后給予一個(gè)非損傷性缺血適應(yīng)，使對已嚴(yán)重缺血的器官產(chǎn)生保護(hù)作用。目前已有研究證實(shí)遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)能對心肌、腎臟、骨豁肌及腦產(chǎn)生缺血保護(hù)作用。四肢由于對缺血較耐受，容易觀察缺血的程度，且容易實(shí)施缺血適應(yīng)、具有事后性，目前已成為研究保護(hù)器官缺血/再灌注損傷方面的熱點(diǎn)。很多研究表明缺血后適應(yīng)能抑制缺血再灌注后炎性反應(yīng)，提高腦循環(huán)，減少梗死面積，提高神經(jīng)再生和血管再生[1]，系統(tǒng)的研究它的臨床應(yīng)用及神經(jīng)保護(hù)機(jī)制加速缺血后適應(yīng)的臨床轉(zhuǎn)化[2]。到目前為止，更多的研究集中在腦缺血急性期的神經(jīng)保護(hù)，在缺血性腦卒中恢復(fù)期對星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的研究尚無報(bào)道。

腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷了快速的增生和肥大，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞形成膠質(zhì)瘢痕抑制軸索的再生和影響細(xì)胞外的微環(huán)境[3,4]。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及解剖學(xué)定位，星形膠質(zhì)細(xì)胞被分為兩大主要亞型，原漿型(GS)和纖維型(GFAP)。GFAP是反應(yīng)性星形細(xì)胞的標(biāo)志， GFAP表達(dá)十種不同的亞型，最經(jīng)典的亞型是GFAPα，在星形膠質(zhì)細(xì)胞的白質(zhì)和灰質(zhì)表達(dá)，最多的可變剪切是GFAPδ，表達(dá)在較低水平， GFAPδ在許多疾病中被誘導(dǎo)變成反應(yīng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞[5,6]，處理反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞亞型和GFAP亞型可提高缺血后神經(jīng)元的可塑性。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)分組 成年雄性C57小鼠，質(zhì)量22～24 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。許可證號：SCXK(京)2008-0001。于恒溫條件下飼養(yǎng) (溫度22 ℃～26 ℃，濕度56%～70%，12/12 h日夜循環(huán))。63只小鼠被隨機(jī)分為3組：(1)假手術(shù)組：小鼠和其他組一樣經(jīng)過同樣的過程但不插入線栓；(2)模型組：給予大腦中動(dòng)脈閉塞1 h再灌注；(3)RIPC組：大腦中動(dòng)脈閉塞后給予RIPC。每組被分為兩個(gè)亞組：3 d組(n=12)3只小鼠用于TTC染色，6只用于計(jì)算缺血側(cè)半球的水腫及蛋白免疫印跡檢測，3只小鼠用于免疫熒光檢測；14 d組(n=9)6只用于計(jì)算缺血側(cè)半球的萎縮和蛋白免疫印跡，3只用于免疫熒光。如果動(dòng)物體重不符合需要被排除，所有的研究采用雙盲。

1.2 小鼠模型的建立 建立局灶性腦缺血模型短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型。小鼠稱重后采用4%～5%恩氟烷誘導(dǎo)麻醉并用面罩吸入1%～2%恩氟烷混合N2O∶O2(7∶3)維持麻醉。術(shù)中通過測量肛溫、心率和平均動(dòng)脈壓來保持各項(xiàng)生理指標(biāo)正常。將直徑為0.19 mm線栓(貨號701956PK5Re)緩慢插入至右頸總動(dòng)脈，缺血1 h后拔出線栓，局灶的腦血流量通過經(jīng)顱超聲多普勒(PeriFlux System5000；Perimed，Sweden)觀察證實(shí)。體溫通過直腸探針檢測，通過加熱毯維持在(37.0±0.5)℃。MCAO再灌注后，小鼠被隨機(jī)挑選即刻給予RIPC。為了造成肢體缺血，兩個(gè)肢體末端用橡皮帶做成一個(gè)小的橡皮管形成一個(gè)可逆性的勒除器。用勒除器結(jié)扎小鼠雙后肢根部(約股動(dòng)脈近端1/5～2/5的位置)阻斷雙側(cè)股動(dòng)脈，雙側(cè)股動(dòng)脈被阻斷10 min放開10 min，如此循環(huán)3次。在阻斷的過程中，傳感器置于雙側(cè)的足背動(dòng)脈檢測脈沖決定是否肢體的血流被阻斷。如果脈沖消失證明肢體缺血，并且肢體變蒼白。再灌注后，肢體恢復(fù)正常的粉紅色。RIPC結(jié)束后，小鼠放回籠子里，觀察它們的正常活動(dòng)，包括行走、進(jìn)食和睡眠。

1.3 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 小鼠的運(yùn)動(dòng)功能在自動(dòng)化的旋轉(zhuǎn)棒上被評估。小鼠被放在加速的旋轉(zhuǎn)棒上(4～40 rpm over 120 s) 并且他們潛在的掉落次數(shù)被記錄。在手術(shù)前3 d給予同樣的訓(xùn)練。MCAO后，在3 d、14 d檢測小鼠的情況。每天檢測3次，取掉落的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 檢測梗死面積、半球水腫和腦萎縮 神經(jīng)系統(tǒng)功能評定后，在再灌注3 d、14 d用10%水合氯醛致死劑量腹腔注射處死小鼠，距離大腦前極開始，在腦模具中切出冠狀切片1 mm厚度腦片6片，將腦片放入TTC (TTC；Sigma，USA)溶液中，常溫下20 min后撈出放入多聚甲醛固定液中，正常腦組織呈玫紅色，梗死區(qū)腦組織呈白色，拍照。應(yīng)用Image J軟件分析梗死體積比率。梗死體積的計(jì)算根據(jù)下面的公式[7]：梗死體積%=[(非缺血側(cè)面積總和-非梗死面積)/非缺血側(cè)面積總和]×100%。相對腦水腫比率=[(缺血側(cè)面積總和-非缺血側(cè)面積總和)/非缺血側(cè)面積總和]×100%。相對腦萎縮比率=[(非缺血側(cè)面積總和-缺血側(cè)面積總和)/非缺血側(cè)面積總和]×100%[8]。

1.5 Western blot分析蛋白的表達(dá) 腦組織在3 d、14 d被收集，缺血側(cè)腦組織在緩沖液中處理(RIPA；Cell Signaling Technology，USA)，包括蛋白酶抑制劑(Thermo，USA)和用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)粉碎組織細(xì)胞，在冰上靜置1 h后用12000 g的低溫離心機(jī)離心30 min；測蛋白濃度，之后以校正過的BCA標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸光值對濃度(μg/ml)做圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計(jì)算待測樣品蛋白濃度。在Excel表中算出每100 μl需要加入的 Loading-Buffer的量，統(tǒng)一1 μl內(nèi)的蛋白質(zhì)含量。已經(jīng)加入 Loading-Buffer 的標(biāo)本-20 ℃冰箱凍存，剩余標(biāo)本原液-80 ℃冰箱凍存。Western blot的操作按以前的方法[9]，將醋酸纖維素膜浸入配置好的一抗溶液中4 ℃冰箱過夜； GFAP (1∶1000,Santa Cruz)，GS(1∶1000,Abcam)， GFAPa (1∶1000,Santa Cruz)，GFAPδ (1∶1000,Abcam) 和 β-actin (1∶1000,Santa Cruz)。 然后加入二抗(1∶5000,Abgent,USA),通過凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析目標(biāo)條帶的凈光密度值和分子量。用 AlphaEaseFC圖像分析軟件計(jì)算出每個(gè)條帶MBP及相對應(yīng)的β-actin灰度值，并用(MBP灰度值)/(β-actin灰度值)計(jì)算出相對灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 免疫熒光 免疫熒光染色像以前的描述[10]。在再灌注3 d、14 d用10%水合氯醛致死劑量腹腔注射處死小鼠，腦組織冰凍切片復(fù)溫后放入4%的多聚甲醛中固定，PBS沖洗后，用含有1%BSA、5%的山羊血清和0.1%的Triton X-100的PBS溶液20 ℃～25 ℃封閉1 h，以阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。將封閉液洗掉加入按照一定比例稀釋的一抗結(jié)合4 ℃孵育過夜。次日，將切片取出，然后加入熒光二抗，然后用防淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡(Olympus,Japan)下找到紅色熒光和綠色熒光并拍照并用FV10-ASW 2.0軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 RIPC 降低梗死面積、缺血半球腦水腫和腦萎縮，提高腦缺血小鼠的神經(jīng)功能及生存率 5種方法測量腦組織的損傷：腦梗死體積、腦水腫、腦萎縮、神經(jīng)功能評分、生存率。缺血在灌注后缺血半球的梗死體積(見圖1A、B)：缺血在灌注后定量分析顯示缺血半球的梗死體積顯著增加。RIPC治療后顯著降低缺血半球的梗死體積，由模型組的60%降低到40%。腦水腫是另一個(gè)常見的方法來評價(jià)缺血再灌注腦損傷。我們的數(shù)據(jù)顯示RIPC能顯著降低缺血再灌注3 d腦組織腫脹(見圖1C、D)。為了研究RIPC在恢復(fù)期的保護(hù)作用，我們檢測了腦缺血再灌注14 d腦萎縮的情況。我們發(fā)現(xiàn)RIPC在14 d能降低腦萎縮的程度(見圖1E、F)。14 d的結(jié)果更顯著的表明RIPC在急性期和恢復(fù)期對腦缺血再灌注都具有保護(hù)作用，為我們進(jìn)一步研究RIPC的保護(hù)作用提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。神經(jīng)功能評分我們選擇了在缺血后3 d、14 d進(jìn)行轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)。相對于MCAO組，RIPC能夠顯著降低缺血后運(yùn)動(dòng)功能缺陷，增加轉(zhuǎn)棒的時(shí)間和路程，因此我們推斷RIPC能夠提高缺血后的神經(jīng)功能(P<0.05，見圖1G)。缺血再灌注后我們還檢測了14 d的生存率，顯示RIPC能提高缺血后的生存率，在MCAO組14 d，我們觀察到幾乎有50%的動(dòng)物死亡，而RIPC組生存率從55%提高到77%，表明RIPC對腦缺血再灌注有顯著的保護(hù)作用(見圖1H)。

2.2 RIPC改變?nèi)毖T導(dǎo)的GFAP和GS的表達(dá) 星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的適應(yīng)性改變是腦水腫形成的主要原因[11]。星形膠質(zhì)細(xì)胞的畸形生長會(huì)形成膠質(zhì)瘢痕，影響神經(jīng)修復(fù)。結(jié)果顯示在3 d缺血后增加的GFAP的表達(dá)經(jīng)過RIPC治療后顯著的降低，這意味著RIPC對GFAP有抑制作用 (見圖2A、B)。 而且，RIPC不影響缺血在灌注后GS的表達(dá)(見圖2A、C)。為了研究RIPC能否在恢復(fù)期影響反應(yīng)性星形細(xì)胞膠質(zhì)化，我們檢測了缺血再灌注14 d，GFAP和GS蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果顯示缺血誘導(dǎo)的GFAP的表達(dá)經(jīng)過RIPC治療后沒有顯著的差異。GS的蛋白表達(dá)水平經(jīng)RIPC治療后顯著升高(P<0.05,見圖2D～F)，說明在恢復(fù)期RIPC可能通過改變GS的表達(dá)發(fā)揮作用。同時(shí)，我們利用免疫熒光還觀察了在皮質(zhì)缺血周圍區(qū)GFAP的情況。我們觀察到在缺血周邊區(qū)有大量增加的GFAP的表達(dá)，RIPC治療后GFAP的表達(dá)有所減少(見圖2G)。

2.3 RIPC 調(diào)節(jié)GFAP亞型的比例 星形膠質(zhì)細(xì)胞不同的亞型在神經(jīng)修復(fù)中發(fā)揮不同的作用。在正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，GFAPδ∶GFAPα為1∶3是最適合的網(wǎng)絡(luò)組成。WB的結(jié)果顯示缺血再灌注3 d，小鼠缺血側(cè)腦組織GFAPδ 的表達(dá)無明顯的改變，而 GFAPα顯著增加，導(dǎo)致 GFAPδ/GFAPα 的比率降低到1∶5；RIPC 治療明顯降低缺血后GFAPα的表達(dá)， 同時(shí)增加GFAPδ/GFAPα的比率(見圖3A～D,P<0.05)。因此， RIPC 能調(diào)節(jié)它們的比率達(dá)到最佳的網(wǎng)絡(luò)組成(見圖3A～D)。然后，我們觀察缺血再灌注14 d后GFAP亞型的變化。WB結(jié)果顯示，經(jīng)RIPC治療后GFAPα 和 GFAPδ 沒有明顯的變化(見圖3E～H)。但是RIPC能調(diào)節(jié)它們的比率達(dá)到最適的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成(見圖3H,P<0.05)。

圖1 遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)能提高缺血小鼠的存活率，減少神經(jīng)功能缺損、梗死體積、腦半球腫脹和腦萎縮。A、B：據(jù)腦區(qū)2、3、5-三苯基四唑氯化物染色的區(qū)域損失來測定梗死灶的體積(N=3)，給予RIPC后，梗死面積減少(P<0.05，與MCAO組相比)。C、D：與MCAO組相比，RIPC在3 d能顯著降低缺血側(cè)半球的腫脹(N=6) (P<0.05)。E、F:RIPC在14 d能顯著降低缺血側(cè)半球的萎縮(N=6) (P<0.05，與MCAO組相比)。 G:缺血再灌注后3 d、14 d用轉(zhuǎn)棒能力來評價(jià)神經(jīng)功能。給予RIPC后，3 d、14 d的轉(zhuǎn)棒能力均有所提高(P<0.05)。H:RIPC 14 d的生存率顯著提高

圖2 遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)改變?nèi)毖T導(dǎo)的GFAP和GS的表達(dá)。在缺血再灌注3 d、14 d，我們用WB檢測缺血側(cè)GFAP及GS的表達(dá)。A～C:顯示缺血再灌注3 d后GFAP及GS的表達(dá)顯著升高，給予RIPC治療后，GFAP顯著降低(P<0.05，與MCAO組相比)，但GS無明顯變化(N=6)。D～F:結(jié)果顯示，在缺血再灌注14 d，GFAP逐漸增多(P<0.05，與SHAM組相比)，GS無明顯變化(與SHAM組相比)。 RIPC治療后，GFAP無明顯變化(與MCAO組相比)，但GS的表達(dá)顯著升高(P<0.05，與MCAO組相比) (N=6)。G:免疫熒光觀察缺血周邊區(qū)GFAP的表達(dá)(N=3)(×20)

圖3 遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞亞型的比例。缺血再灌注3 d,A～D:可以看出MCAO后GFAPδ 的表達(dá)無明顯的改變而 GFAPα顯著增加(P<0.05與SHAM組相比)，導(dǎo)致 GFAPδ/GFAPα 的比率降低到1∶5。RIPC治療明顯降低缺血后GFAPα的表達(dá)(P<0.05與MCAO組相比)， 同時(shí)增加GFAPδ/GFAPα的比率(P<0.05與MCAO組相比)。14 d,E～H:WB檢測缺血側(cè)GFAPα 和 GFAPδ 的表達(dá)(N=6):MCAO后GFAPα的表達(dá)增加(P<0.05與SHAM組相比)，RIPC治療后GFAPα 和 GFAPδ 沒有明顯的變化，但是RIPC能調(diào)節(jié)它們的比率(P<0.05與MCAO組相比)

3 討 論

腦缺血導(dǎo)致過表達(dá)的激活和增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕的形成。細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞從營養(yǎng)保護(hù)神經(jīng)元轉(zhuǎn)為釋放神經(jīng)毒性，引起嚴(yán)重的神經(jīng)元損害[12～14]。我們的研究證實(shí)RIPC能減少激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此提高神經(jīng)功能，減少死亡率，減少3 d梗死面積和缺血半球的腦腫脹，減少14 d的腦萎縮。

星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化是腦缺血的標(biāo)志。由于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的不同，星形膠質(zhì)細(xì)胞組成成分也明顯不同。基因表達(dá)對損傷反應(yīng)有益和有害雙重反應(yīng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞分為兩大主要亞型，原漿型和纖維型。纖維型星形膠質(zhì)細(xì)胞主要分布在白質(zhì)，與少突膠質(zhì)細(xì)胞相互作用提高髓鞘形成[15]。原漿型星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元和毛細(xì)血管聯(lián)系，構(gòu)成神經(jīng)血管單元。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞在突觸的發(fā)展和血腦屏障的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。GS是原漿型星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志，并且有許多功能，例如調(diào)節(jié)谷氨酸鹽的代謝、腦氨的解毒和同化、神經(jīng)遞質(zhì)的循環(huán)和神經(jīng)信號的終止[16]。卒中后3 d，星形膠質(zhì)細(xì)胞的亞型標(biāo)志物GFAP和GS均增高，RIPC能顯著的降低GFAP的表達(dá)，但不能降低GS的表達(dá)水平，表明RIPC能顯著降低纖維型星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，但對原漿型星形膠質(zhì)細(xì)胞無影響。14 d缺血誘導(dǎo)的GFAP的表達(dá)經(jīng)過RIPC治療后沒有顯著的差異。但是GS的蛋白表達(dá)水平經(jīng)RIPC治療后顯著升高，以上的數(shù)據(jù)證實(shí)了持續(xù)的RIPC能夠影響星形膠質(zhì)細(xì)胞亞型的表達(dá)，使星形膠質(zhì)細(xì)胞從纖維型轉(zhuǎn)變?yōu)樵瓭{型，因此降低了谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性及增加缺血后神經(jīng)元的保護(hù)作用。

此外，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞集中在白質(zhì)并釋放大量的酸性蛋白，這在膠質(zhì)瘢痕的形成過程中起著關(guān)鍵作用[17]。GFAP基因是被剪切的結(jié)合體，到目前為止，人類大腦中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10種不同的亞型。最經(jīng)典的亞型是GFAPa，最大量的可變剪切變體是GFAPδ[18]，在健康的大腦中，GFAPa在腦室中表現(xiàn)為灰質(zhì)和白質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，軟膜下和沿腦室起源于神經(jīng)組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞，而GFAPδ則表現(xiàn)在較低的水平，主要表現(xiàn)在軟膜下和室管膜下起源于神經(jīng)組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞。高表達(dá)的GFAPδ導(dǎo)致細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)組的倒塌[19,20]，由于GFAPδ的增加或GFAPa的減少導(dǎo)致比率的改變會(huì)改變層粘蛋白和網(wǎng)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞的黏附和遷移。已有報(bào)道GFAPδ在許多疾病中被誘導(dǎo)為反應(yīng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞[21]。本實(shí)驗(yàn)中，缺血后GFAPa的表達(dá)顯著增高，但是GFAPδ的表達(dá)無明顯改變，RIPC治療后能降低的蛋白表達(dá)并明顯增加GFAPδ/GFAPα的比率，已有實(shí)驗(yàn)顯示GFAPδ/GFAPα的比率為1∶3是GFAP最適的網(wǎng)絡(luò)組成[22]，在目前的研究中，RIPC不僅減少了總GFAP的表達(dá)，而且還調(diào)整了GFAPδ/GFAPα的比例，改變了GFAP的亞型，從而為GFAP的最佳網(wǎng)絡(luò)組成提供了幫助，并進(jìn)一步改善了卒中后的神經(jīng)功能?？偠灾?，GFAP在許多細(xì)胞過程中發(fā)揮作用。GFAP表達(dá)的改變可以促進(jìn)突觸功能，改變谷氨酸-谷氨酰胺的代謝，從而擴(kuò)大了星形細(xì)胞膜所接觸的神經(jīng)元表面的面積。而且，GFAP亞型表達(dá)的改變能導(dǎo)致功能的改變，GFAP亞型比率的改變也能調(diào)整星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能并影響周圍的神經(jīng)元。必須指出的是進(jìn)一步研究GFAP特定的引物和闡明機(jī)制，結(jié)果，功能影響星形膠質(zhì)細(xì)胞不同的亞群特定的網(wǎng)絡(luò)組成，這對RIPC的進(jìn)一步治療和臨床轉(zhuǎn)化是有益的。

總之，目前的研究顯示 RIPC 可通過調(diào)節(jié)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的可塑性，在卒中后幫助恢復(fù)腦的神經(jīng)功能。RIPC能直接影響膠質(zhì)瘢痕的形成可能與減少梗死面積相關(guān)，這需要進(jìn)一步證實(shí)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為RIPC提高缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)提供了進(jìn)一步的證據(jù)，并且表明長期實(shí)施RIPC可以減輕卒中后損傷。