張榮紅，賈鐵文，何志旭，劉杰麟＊＊

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞中心，貴州貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，貴州貴陽 550004)

RecQ解旋酶是DNA解旋酶SF2超家族中的一個家族［1］，在生物體內(nèi)起著至關(guān)重要的作用，諸如DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等［2］。人類有5種RecQ 解旋酶 (RecQ1，WRN，BLM，RecQL4 和RecQ5)，其中BLM、WRN和RecQ4基因的突變分別會引起B(yǎng)loom綜合征、Werner綜合征以及Rothmund-Thomson綜合征，這些綜合征加速老化癥狀和癌癥發(fā)病率［2－8］。此外，RecQ1、BLM、RecQ4、RecQ5 等在多種腫瘤中均高表達(dá)［9－15］，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲、耐藥與代謝密切相關(guān)。這些研究結(jié)果均提示RecQ解旋酶與腫瘤關(guān)系密切，有望成為腫瘤診斷標(biāo)志或腫瘤治療的新靶點(diǎn)。由于大腸桿菌RecQ解旋酶的3個功能結(jié)構(gòu)域與人RecQ解旋酶高度同源，其結(jié)構(gòu)及功能與人類RecQ解旋酶極為類似，是研究人類 RecQ解旋酶的重要模型［16］，文獻(xiàn)報道從大腸桿菌中獲得了高純度的RecQ解旋酶具有DNA結(jié)合活性［17－18］。單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)作為一種高效的生物制品在腫瘤的診斷和治療方面顯示出極大的應(yīng)用價值，且單克隆抗體的制備技術(shù)是一項(xiàng)非常成熟的技術(shù)手段［19］。然而，目前抗RecQ解旋酶mAb方面的相關(guān)報道甚少，本研究使用純化的重組大腸桿菌RecQ解旋酶免疫小鼠，利用雜交瘤技術(shù)及有限稀釋法制備抗RecQ解旋酶的mAb，并考察其特異性及活性。

1 材料和方法

1.1 材料

8～10周齡雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。純化后的重組大腸桿菌RecQ解旋酶、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞為貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心儲存。胎牛血清、超級新生牛血清購自杭州四季青公司，甲基纖維素、Freund完全佐劑(Freund＇s complete adjuvant，F(xiàn)CA)、Freund 不完全佐劑(Freund＇s incomplete adjuvant，F(xiàn)IA)、PEG4000 購自 Sigma 公司，RPMI1640培養(yǎng)基(粉劑)購自Gibco公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司，mAb亞型鑒定試劑盒購自中國洛陽塞爾維公司，考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，秋水仙素溶液購自北京百奧萊博科技有限公司。X射線膠片購自柯達(dá)，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，96孔、24孔、6孔培養(yǎng)板購自Costar公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原的鑒定 通過對重組大腸桿菌RecQ解旋酶的誘導(dǎo)表達(dá)［17］，獲得純度高、活性好的大腸桿菌重組RecQ解旋酶，具有DNA結(jié)合活性、ATP依賴的DNA解鏈活性等?？乖竽c桿菌重組RecQ解旋酶按南京建成生物工程研究所“考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒”說明書操作，檢測純化后重組大腸桿菌RecQ解旋酶蛋白濃度，并用SDS-PAGE上樣測定抗原重組大腸桿菌RecQ解旋酶蛋白的純度。

1.2.2 小鼠免疫及抗體效價檢測 以純化鑒定后的重組大腸桿菌RecQ解旋酶免疫Balb/c小鼠，參考文獻(xiàn)［20］操作。根據(jù)方陣滴定試驗(yàn)確定抗原包被濃度，間接ELISA測定小鼠血清抗體效價。

1.2.3 細(xì)胞融合 取免疫小鼠的脾細(xì)胞，并收集處于對數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按10∶1的比例混合，1 000 r/min離心5 min洗滌2次，棄上清，取50%PEG 1 mL，1 min內(nèi)沿管壁緩緩滴入兩種混合細(xì)胞中，同時輕輕搖晃，加完后用吸管輕輕攪拌數(shù)秒后靜置2 min;用RPMI-1640不完全培養(yǎng)基多次分批終止反應(yīng)，800 r/min離心5 min，棄上清，得細(xì)胞沉淀。

1.2.4 有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞 參照文獻(xiàn)［21］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(1)融合細(xì)胞沉淀中加入HAT培養(yǎng)基重懸;將細(xì)胞懸液以100μL/孔鋪于96孔培養(yǎng)板中，同時鋪適當(dāng)復(fù)孔的SP2/0細(xì)胞作為HAT選擇培養(yǎng)的陰性對照。(2)融合3 d后，鏡下觀察細(xì)胞克隆生長情況并標(biāo)記，以后2周每隔2 d用HAT選擇培養(yǎng)基半量換液，并收集上清間接ELISA法進(jìn)行檢測。在第2周后和4周分別換成HT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，選取最強(qiáng)陽性克隆進(jìn)行亞克隆。(3)在有限稀釋前一天收集未經(jīng)免疫Balb/c小鼠的腹腔細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，HAT選擇性培養(yǎng)基重懸后按100μL/孔鋪到96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜。(4)亞克隆:用HT選擇培養(yǎng)基將陽性雜交瘤細(xì)胞稀釋成100個/mL、50個/mL、10個/m3個濃度，按100μL/孔分別加入到含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d。(5)第4天起開始在顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆情況，對單細(xì)胞克隆孔進(jìn)行標(biāo)記;7 d后用RPMI-1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行半量換液，同時收集上清做間接ELISA檢測。(6)重復(fù)多次有限稀釋，直到所有僅一個細(xì)胞集落生長的培養(yǎng)液上清ELISA檢測結(jié)果均為陽性為止。

1.2.5 腹水制備mAb (1)小鼠的預(yù)處理:選取10周齡的健康、雌性Balb/c經(jīng)產(chǎn)鼠數(shù)只，在接種雜交瘤細(xì)胞前2周，每只小鼠腹腔注射醫(yī)用液體石蠟0.5 mL;預(yù)處理過的小鼠在2～3個月內(nèi)均可使用。(2)收集對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞1C1，離心，棄上清，用不完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個/mL，0.5 mL/只腹腔注射。(3)約1～2周后，見小鼠腹部明顯膨大，用12號無菌針頭從腹股溝上緣插入腹腔中，輕輕擠壓小鼠腹部，放出腹水，收集于無菌離心管3 000 r/min離心15 min，去除上層油脂，分裝保存于－80℃。隔天穿刺一次直至小鼠死亡。

1.2.6 mAb鑒定及生物學(xué)特性的分析 雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)分析:取雜交瘤細(xì)胞，加入秋水仙素液，37℃培養(yǎng)6 h后收獲細(xì)胞，低滲處理、固定、制片、染色、鏡檢、照相，對染色體計數(shù)。mAb類型及亞型的鑒定:按照洛陽塞爾維公司單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明進(jìn)行操作。mAb效價的測定:間接ELISA測定腹水、雜交瘤細(xì)胞上清抗體滴度，以Sp2/0培養(yǎng)液為陰性對照。雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性研究:將雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)3個月，定期用間接ELISA測其培養(yǎng)液中的抗體活性，觀察雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性。

1.2.7 mAb特異性鑒定 參照文獻(xiàn)［22］方法鑒定mAb的特異性。純化的RecQ解旋酶經(jīng)SDSPAGE，轉(zhuǎn)膜后用BALB/c小鼠腹水mAb做一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(工作濃度1∶5 000)做二抗，DAB顯色。

1.2.8 mAb功能活性的測定 將mAb進(jìn)行系列梯度稀釋13個濃度后與定量(10μL)的純化RecQ蛋白混勻，置37℃水浴中孵育2 h。采用熒光偏振檢測技術(shù)［23］分析不同濃度的mAb阻斷RecQ解旋酶與DNA結(jié)合的能力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn);P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RecQ解旋酶蛋白的純度

將純化后的重組RecQ蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，重組RecQ蛋白經(jīng)鎳柱層析純化后無雜帶，純度高，其分子量約為69 kD，與預(yù)期分子量相符，濃度為1.834 g/L，可作為抗原免疫小鼠。

2.2 抗原包被最佳濃度的確定

用方陣法篩選抗原最佳包被濃度，結(jié)果見表1，根據(jù)表中結(jié)果可知，抗原包被濃度為0.2 mg/L，血清稀釋度為1/1 000時，OD490測定結(jié)果接近0.9，可獲得較好的檢測結(jié)果。因此，抗原包被的最佳工作濃度為0.2 mg/L。

表1 不同抗原包被濃度下的OD490值Tab.1 OD values at 490 nm under different concentrations of antigen

2.3 有限稀釋法獲得抗RecQ解旋酶雜交瘤細(xì)胞株1C1

在細(xì)胞融合后第3天即可見雜交瘤細(xì)胞成集落性生長，11 d后可見部分培養(yǎng)孔的雜交瘤細(xì)胞生長至孔底的近1/3。雜交瘤細(xì)胞鏡下呈圓形，比SP2/0骨髓瘤略大，細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，見圖1。第3天半量換液時即用間接ELISA法對培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測，此后每次半量換液均進(jìn)行復(fù)測，將反復(fù)多次檢測為陽性結(jié)果的細(xì)胞用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。本方法結(jié)果得到1株陽性克隆，編號為“1C1”，經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)并反復(fù)檢測，該細(xì)胞株在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)3月以上仍可穩(wěn)定分泌抗RecQ單克隆抗體，見表2。

圖1 雜交瘤細(xì)胞形態(tài)(有限稀釋法)Fig.1 The morpha of a hybridoma colony(limited dilution)

表2 雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性Tab.2 The stability of the hybridoma-secreting mAb

2.4 抗RecQ解旋酶mAb生物學(xué)特性及鑒定

所獲得1C1陽性雜交瘤細(xì)胞株的染色體數(shù)目為94～104條(圖2A)，是兩種親本細(xì)胞的染色體數(shù)目之和。染色體核型主要為端著絲粒，少數(shù)為中著絲粒(圖2B)。通過洛陽塞爾維公司生產(chǎn)的單克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定所得mAb的亞類為IgG1(見表3)。間接ELISA法檢測1C1培養(yǎng)上清的抗體效價為1×10－3，誘生的腹水抗體效價為1×10－5。Western blot可觀察到69 000 kD處有清晰特異性條帶圖2C，表明抗RecQ解旋酶mAb能與RecQ解旋酶產(chǎn)生特異性反應(yīng)。

圖2 抗RecQ解旋酶mAb的鑒定Fig.2 Identification of RecQ helicase mAb

表3 間接ELISA法鑒定單克隆抗體亞類Tab.3 mAb subtype determined by indirect ELISA assay

2.5 單克隆抗體對RecQ解旋酶活性抑制的結(jié)果

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)抗RecQ解旋酶mAb的稀釋度在1∶800時，RecQ蛋白結(jié)合DNA的活性明顯降低，并隨抗體稀釋濃度的增加，RecQ蛋白的DNA結(jié)合活性逐漸恢復(fù)(圖3)。表明制備的抗RecQ解旋酶mAb具有抑制RecQ蛋白結(jié)合DNA的活性，且在1∶800稀釋度時活性最佳。

圖3 不同濃度mAb對RecQ蛋白結(jié)合DNA活性的影響Fig.3 The effect of different concentration of mAb on DNA binding activity of RecQ

3 討論

單克隆抗體技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具，其在基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究方面有著不可或缺的作用，在人類和動植物的免疫學(xué)診斷方面至今仍有著無可代替的重要作用。Khler和Milstein于1975年利用雜交瘤技術(shù)成功建立了單克隆抗體制備技術(shù)［22］，據(jù)估計在近四年內(nèi)mAb的全球市值超1 250億美元［23］，具有廣闊市場和應(yīng)用前景［23－24］。

RecQ解旋酶在維持DNA正常代謝及維護(hù)染色體穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用，雖然RecQ解旋酶的作用機(jī)制目前仍不十分明確，但研究表明RecQ解旋酶的突變、缺失或功能失常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［9－15］，并有望成為新的腫瘤標(biāo)志物或成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。駱衡等［17］通過誘導(dǎo)大腸桿菌體外表達(dá)，獲得了高純度的RecQ解旋酶，具有DNA結(jié)合活性、ATP依賴的DNA解鏈活性以及DNA依賴的ATP酶活性，相比雙鏈DNA，該RecQ解旋酶更易與單鏈DNA結(jié)合。黃振蓉等［18］通過PCR也從大腸桿菌中獲得純度大于90%的RecQ解旋酶，具有DNA依賴性和蛋白濃度依賴性的ATP水解活性。目前只有1例成功獲得抗RecQ解旋酶mAb的報道［18］，本課題組通過甲基纖維素半固體篩選得到能穩(wěn)定分泌抗RecQ解旋酶mAb的雜交瘤細(xì)胞株6H5。文獻(xiàn)報道表明，有限稀釋法與甲基纖維素半固體法是雜交瘤細(xì)胞篩選及克隆化培養(yǎng)的兩種常用方法［25－26］。為了探究不同方法對抗RecQ解旋酶mAb的分泌是否有影響，本實(shí)驗(yàn)選擇純化后重組大腸桿菌RecQ解旋酶作為抗原，在陽性免疫應(yīng)答后，分離脾細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞融合，以產(chǎn)生穩(wěn)定、長壽的抗體產(chǎn)生細(xì)胞系—雜交瘤細(xì)胞，并采用有限稀釋法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選及克隆化培養(yǎng)，獲得了能穩(wěn)定分泌抗RecQ解旋酶mAb的細(xì)胞株1C1，染色體數(shù)目為94～104。該雜交瘤細(xì)胞具有持久分泌抗體的能力，其分泌的抗體類型為IgG1型，培養(yǎng)上清的抗體效價為1×10－3，誘生的腹水抗體效價為1×10－5，該mAb能特異性地與RecQ解旋酶結(jié)合，且在1/800時可顯著抑制RecQ解旋酶與DNA的結(jié)合，與半固體法得到的6H5抗體相比，效價稍低，但活性相當(dāng)，都具有相同的生物活性。

綜上所述，有限稀釋法作為傳統(tǒng)篩選方法，技術(shù)成熟，操作簡單，成本較低，應(yīng)用廣泛，作為科學(xué)研究，目前大多數(shù)單克隆抗體的制備仍采用有限稀釋法篩選制備。該抗RecQ解旋酶mAb的成功獲得為進(jìn)一步研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤的診斷及治療提供了有力的工具。