康楊婷，黃媛馨，伍國(guó)鋒

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州貴陽(yáng) 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院急診神經(jīng)科，貴州貴陽(yáng) 550004)

癲癇(epilepsy，EP)是多種原因?qū)е碌囊阅X部神經(jīng)元高度同步化異常放電為主要表現(xiàn)的臨床綜合征［1］，伴有短暫的運(yùn)動(dòng)、感覺、意識(shí)及自主神經(jīng)功能異常，具有病因多樣性、發(fā)作反復(fù)性、癥狀復(fù)雜性、表現(xiàn)形式單一等特點(diǎn)［2］。目前常用氯化鋰－匹羅卡品腹腔注射建立EP大鼠模型，使用單次大劑量匹羅卡品腹腔注射可以獲得較高的致癇性動(dòng)物模型，但致死率較高［3－4］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，小劑量反復(fù)腹腔注射匹羅卡品可建立大鼠顳葉EP模型，能夠獲得較高致癇率及較低致死率［4－6］，但關(guān)于單次小劑量匹羅卡品對(duì)大鼠大腦影響的研究目前尚未發(fā)現(xiàn)。本研究旨在探討單次予以小劑量匹羅卡品對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠杏仁核電活動(dòng)及海馬組織的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康成年雄性SD大鼠40只、SPF級(jí)、體質(zhì)量180～220 g、日齡60～90 d，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度22～26℃，濕度恒定。采用單籠喂養(yǎng)、自由進(jìn)食，讓動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境。

1.2 方法

1.2.1 分組、給藥及記錄腦電波 將40只大鼠隨機(jī)均分為正常對(duì)照組(NC組)與小劑量匹羅卡品實(shí)驗(yàn)組(PC組)，立即在兩組動(dòng)物中分別在杏仁核植入記錄電極。PC組大鼠在術(shù)后第7天腹腔注射氯化鋰125 mg/kg，18 h后再給予腹腔注射10 mg/kg匹羅卡品;NC組在術(shù)后第7天僅予以相同次數(shù)、相同劑量的生理鹽水腹腔注射，不予注射氯化鋰－匹羅卡品。

1.2.2 標(biāo)本處理 于藥物處理后2周末，采集SD大鼠杏仁核區(qū)的腦電圖。用10%的水合氯醛麻醉大鼠后，將大鼠固定、暴露胸腔，用眼科剪剪開大鼠的右心耳處，經(jīng)大鼠左心室快速灌注0℃預(yù)冷的生理鹽水500 mL置換出體內(nèi)的血液，待右心耳缺口處流出清亮液體后，用預(yù)先配置好的PBS 500 mL灌注，灌注結(jié)束后斷頭取腦，迅速分離出海馬組織。將一側(cè)海馬組織浸泡于4%多聚甲醛EP管中，4℃冰箱中固定過夜;另一側(cè)海馬組織冷凍之后裝入無(wú)酶的EP管中，于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆米鯳estern Blot檢測(cè)γ－氨基丁酸A(GABAA)受體。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 記錄腦電圖波幅及頻率 兩組大鼠均在藥物注射后第7天描記腦電圖1 h，首先連續(xù)記錄15 min，然后每隔5 min記錄10 min，1 h內(nèi)完成。腦電圖資料用隨機(jī)軟件計(jì)算出波幅和頻率。

1.3.2 海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)及GABAA受體 將予以多聚甲醛處理的組織用自來(lái)水反復(fù)沖洗后，用75%的酒精中行常規(guī)脫水24 h，分別浸泡在二甲苯Ⅰ透明化處理60 min和二甲苯Ⅱ中透明化處理40 min，再進(jìn)行包埋切片。將組織蠟塊切成5μm厚的薄片置于用多聚賴氨酸包被的載玻片上，放在60℃的恒溫烤箱中烘烤1 h，室溫下復(fù)溫1 h后透明處理15 min，將脫蠟后的切片經(jīng)100%、95%、85%、75%的酒精分別浸泡5 min，純水沖洗10 min，并將切片放入事先預(yù)熱至60℃1%甲苯胺藍(lán)染液中浸染30 min。浸染結(jié)束后，純水沖洗6 min，然后經(jīng)95%的酒精迅速分化1 min，無(wú)水乙醇脫水、透明、中興樹膠封片。通過顯微鏡拍照，觀察海馬細(xì)胞數(shù)以及GABAA受體的表達(dá)。

1.3.3 檢測(cè)GABAA受體 稱取約10 mg的海馬組織置于事先預(yù)冷的EP管內(nèi)，向EP管中加入200μL預(yù)冷的蛋白裂解液、再加入蛋白酶抑制劑2μL，充分混勻后置于冰上超聲破碎儀破壞海馬組織。用高壓滅菌后的移液器槍頭將研磨好的組織液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的預(yù)冷的EP管中，配平后放入4℃離心機(jī)中，14 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，采用 BCA分光光度法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)量完畢后置于－80℃冰箱中冷凍保存，然后制膠、加樣，通過凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體及曝光處理后觀察兩組大鼠的海馬組織中的GABAA受體的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0軟件分析數(shù)據(jù)，所測(cè)得數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)表現(xiàn)

PC組大鼠予以小劑量匹羅卡品腹腔注射后，未發(fā)現(xiàn)大鼠有點(diǎn)頭、肢體抽搐等行為學(xué)改變;NC組予以相同劑量的生理鹽水處理后也未觀察到異常行為學(xué)變化。

2.2 腦電圖波幅及頻率

兩組大鼠藥物處理后第7天，PC組大鼠杏仁核后放電的頻率及波幅均明顯高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠腹腔注射后杏仁核后放電的波幅及頻率(±s)Tab.1 Amplitude and frequency of posterior amygdaloid discharges after intraperitoneal injection in rats of both groups

表1 兩組大鼠腹腔注射后杏仁核后放電的波幅及頻率(±s)Tab.1 Amplitude and frequency of posterior amygdaloid discharges after intraperitoneal injection in rats of both groups

分組 杏仁核后放電波幅(μV)杏仁核后放電頻率(Hz)PC組50.69 ±0.52 8.8 ±1.1 NC 組 20.8 ±0.84 5.0 ±0.7 t－67.480 6.517 P 0.000 0.000

2.3 海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)

注射2周后，PC組SD大鼠在CA1、CA3、CA4區(qū)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)較NC組明顯減少，海馬椎體細(xì)胞數(shù)量也明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1、圖 2。

圖1 注射兩周后兩組大鼠海馬神經(jīng)元(×200)Fig.1 Hippocampal neuron of rats in both groups

圖2 注射兩周后兩組大鼠海馬椎體細(xì)胞數(shù)Fig.2 Number of hippocampal vertebrae cells of rats in both groups

2.4 海馬GABAA受體

對(duì)兩組大鼠海馬組織GABAA受體的免疫熒光發(fā)現(xiàn)，PC組大鼠海馬細(xì)胞總數(shù)較NC組減少，且PC組海馬組織GABAA受體的表達(dá)量明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。Werstern blot檢測(cè)GABAA受體表達(dá)結(jié)果顯示，PC組大鼠海馬組織GABAA受體表達(dá)較NC組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4。

3 討論

圖3 兩組大鼠海馬組織GABAA受體平均光密度(免疫熒光)Fig.3 Average optical density of GABAA receptor in hippocampus of rats in both groups(immunofluorescence)

圖4 兩組大鼠海馬組織GABAA受體表達(dá)(Werstern blot)Fig.4 Expression of GABAA receptor in hippocampus of rats in both groups

EP是國(guó)內(nèi)外常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，成功地建立EP動(dòng)物模型對(duì)于探討EP的病因、發(fā)病機(jī)制、治療具有重大意義。國(guó)內(nèi)外研究中已成功建立多種EP動(dòng)物模型，如杏仁核點(diǎn)燃模型、海人酸模型、匹羅卡品模型等，查閱相關(guān)文獻(xiàn)表明匹羅卡品EP大鼠模型的病理特征與人類顳葉EP非常相似［7］，是最理想的顳葉 EP 動(dòng)物模型之一［8－9］，它的優(yōu)勢(shì)在于在制造EP模型時(shí)，該模型不用經(jīng)大腦給藥，僅通過腹腔注射便能誘發(fā)EP發(fā)作。因此，對(duì)于在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)行大腦內(nèi)慢病毒注射及顱內(nèi)給藥治療的實(shí)驗(yàn)，該模型是最佳選擇。在正常大鼠中依次予以氯化鋰－大劑量匹羅卡品后，可引起大腦的局限甚至廣泛性損傷，而這種局限或者廣泛性損傷有可能作為EP發(fā)作的病灶，從而引發(fā)慢性EP的自發(fā)性發(fā)作。大鼠氯化鋰－匹羅卡品EP模型在行為學(xué)、腦電圖、病理特性上與人類顳葉EP非常相似，并且具有制作簡(jiǎn)單、誘發(fā)迅速、表現(xiàn)典型、癇性發(fā)作容易確認(rèn)等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來(lái)一直被用于EP發(fā)病機(jī)制和抗EP藥物的研究的較為理想的顳葉 EP模型［10－11］。雖然單次予以大劑量(30 mg/kg)的匹羅卡品致癇性高，但同時(shí)死亡率高，不利于用于EP模型的研究［12－13］，因此較高的死亡率成為該模型的最大弊端。大量的文獻(xiàn)報(bào)道制備EP模型的匹羅卡品的劑量接近其致死量，從而導(dǎo)致了該模型的較高的死亡率，因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于如何減少氯化鋰－匹羅卡品EP模型的死亡率。國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)氯化鋰－反復(fù)小劑量(10 mg/kg)匹羅卡品制備EP模型可以明顯降低大鼠的死亡率，提高大鼠的EP發(fā)病率，使急性期大鼠EP持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生率明顯提高，而死亡率有所下降［14］。國(guó)內(nèi)外研究主要致力于氯化鋰－大劑量匹羅卡品EP模型和氯化鋰－反復(fù)小劑量匹羅卡品模型的研究，而單次小劑量匹羅卡品對(duì)大鼠杏仁核后放電以及海馬組織的影響的研究尚未發(fā)現(xiàn)。給予小劑量的匹羅卡品后，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道幾乎未發(fā)現(xiàn)大鼠會(huì)有相關(guān)癇性發(fā)作［14－15］。本研究通過對(duì)小劑量匹羅卡品大鼠的海馬組織的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小劑量匹羅卡品可以損傷大鼠的的海馬組織，從而證明反復(fù)小劑量匹羅卡品模型可以引起大鼠大腦的廣泛性損傷，使大鼠EP發(fā)作;反復(fù)小劑量給予匹羅卡品可以減少匹羅卡品藥物過量的發(fā)生率，降低匹羅卡品模型的死亡率;通過研究表明小劑量匹羅卡品給予后可以使大鼠杏仁核后放電的頻率及波幅均明顯增加，海馬神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量以及GABAA受體的表達(dá)均明顯減少，從而說(shuō)明小劑量匹羅卡品能增強(qiáng)大鼠的杏仁核電活動(dòng)并導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的丟失，減少GABAA受體的表達(dá)，從而可能提高大鼠的EP易發(fā)性。

綜上，單次小劑量氯化鋰－匹羅卡品腹腔注射更容易誘發(fā)實(shí)驗(yàn)大鼠的EP發(fā)作。這是因?yàn)閱未涡┝科チ_卡品能增強(qiáng)大鼠的杏仁核電活動(dòng)并導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的丟失，減少GABAA受體的表達(dá)，這可能是小劑量單次注射匹羅卡品致癲癇發(fā)生的機(jī)制之一。