楊 健，李 靖，彭 瀟，董 莉，沈艷珍，李勇軍，席曉嵐＊＊，劉 亭＊＊

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點實驗室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州貴陽 550025;3.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州貴陽 550004;4.貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司，貴州修文 550200)

成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)是骨組織中的重要細(xì)胞，起源于具有多向分化潛能的骨髓間質(zhì)細(xì)胞，主要作用是負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌，參與骨礦化。體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞是進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松新藥篩選和藥效學(xué)評價的重要模型［1－3］。骨康膠囊是由補(bǔ)骨脂、續(xù)斷、三七、芭蕉根、酢漿草組方而成的中藥復(fù)方制劑，治療骨質(zhì)疏松有較好療效，且補(bǔ)骨脂是治療骨質(zhì)疏松癥的常用藥物，為歷代醫(yī)家廣泛應(yīng)用于各類補(bǔ)腎健骨方，有調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)化，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖等活性［4－5］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)骨康膠囊中的補(bǔ)骨脂和酢漿草成分對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化有促進(jìn)作用［6－7］，為進(jìn)一步了解骨康膠囊的促骨形成作用機(jī)制，本實驗以骨康膠囊處方中的其他三味藥材續(xù)斷、三七和芭蕉根為研究對象，以成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化為指標(biāo)，觀察組方中的單味藥材對成骨細(xì)胞SaOS-2增殖、分化和礦化的影響，為骨康膠囊的組方優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與試劑 SaOS-2人成骨肉瘤細(xì)胞株購自武漢普諾賽科技生物有限公司，McCoy’s 5a培養(yǎng)基購自上海生工生物工程股份有限公司，胎牛血清、胰蛋白酶、青－鏈霉素，購自美國Gibco公司，堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司，Triton X-100、噻唑藍(lán)(MTT)購自Solarbio公司，BCA蛋白定量試劑盒、哺乳動物蛋白抽提試劑盒均購自中國康為世紀(jì)公司，茜素紅購自sigma公司，人骨鈣素(OTC)ELISA試劑盒、人鈣離子(Ca2+)ELISA試劑盒均購自上海藍(lán)基公司。

1.1.2 儀器 EL204電子天平(上海梅特勒－托利多儀器有限公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo scientific公司)，TS-100F熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，Allegra 64R冷凍高速離心機(jī)(美國Beckman公司)，680型酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人成骨肉瘤細(xì)胞SaOS-2用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%青霉素－鏈霉素的McCoy＇s 5a培養(yǎng)基，在 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將細(xì)胞分為對照組及芭蕉根、續(xù)斷、三七給藥組，在SaOS-2細(xì)胞增殖實驗中，給藥組分別以1、10、100、200、400 和 800 mg/L 芭蕉根、續(xù)斷、三七作用于SaOS-2細(xì)胞，對照組加入不含藥培養(yǎng)基。

1.2.2 藥物配制 芭蕉根、續(xù)斷、三七提取物由貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司提供，用DMSO配制成含芭蕉根、續(xù)斷、三七生藥量為1 g/mL的溶液，于－20℃保存?zhèn)溆?，實驗時用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)的終濃度(DMSO含量小于5‰)。

1.2.3 SaOS-2細(xì)胞增殖檢測 采用MTT法。取對數(shù)生長期各組SaOS-2細(xì)胞接種于96孔板，1×104個/孔，每組5孔，培養(yǎng)24 h后換液;繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入MTT液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄去培養(yǎng)液后加DMSO 100μL/孔，于490 nm波長檢測各組吸光度值。

1.2.4 SaOS-2細(xì)胞ALP活性測定 取對數(shù)生長期的SaOS-2細(xì)胞接種于24孔板，10×104個/孔。培養(yǎng)24 h后，各給藥組更換為含生藥濃度的終濃度分別為10、100及200 mg/L的培養(yǎng)基，對照組為不含藥培養(yǎng)基，每個濃度5孔;繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄上清培養(yǎng)液，培養(yǎng)板用PBS清洗2遍，每孔加入200 μL 0.1%Triton X-100，于冰上裂解10 min，取上清液，用ALP試劑盒測定細(xì)胞ALP活性，并用BCA試劑盒測定細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)含量。用堿性磷酸酶/蛋白總濃度表示ALP的活性。

1.2.5 SaOS-2細(xì)胞Ca2+和OTC檢測 采用ELISA法。取對數(shù)生長期的SaOS-2細(xì)胞接種于24孔板，10×104個/孔;培養(yǎng)24 h后，更換為各組含藥培養(yǎng)基，藥物濃度同1.2.5，每組5孔;培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入哺乳動物蛋白抽提試劑200μL，冰浴10 min。取上清液按人鈣離子ELISA試劑盒和人骨鈣素ELISA試劑盒說明分別測定細(xì)胞Ca2+和OTC含量。

1.2.6 SaOS-2細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)測定 采用茜素紅染色法。取對數(shù)生長期的SaOS-2細(xì)胞接種于24孔板，30×104個/孔，培養(yǎng)24 h后，更換為各組含藥培養(yǎng)基，藥物濃度同1.2.5，每組5孔，隔天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)觀察2周，待形成大量的礦化結(jié)節(jié)后，棄培養(yǎng)液，加PBS清洗2遍，95%乙醇固定10 min，蒸餾水洗滌3次后，加pH 8.3的0.1%茜素紅-Tris-HcL染色30 min，蒸餾水洗滌、干燥，最后于顯微鏡下觀察各孔礦化結(jié)節(jié)的數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SaOS-2細(xì)胞增殖

與對照組比較，芭蕉根水提物濃度在1～800 mg/L時SaOS-2細(xì)胞增殖活性無明顯變化(P＞0.05)。續(xù)斷水提物濃度在10～200 mg/L時能顯著增高SaOS-2細(xì)胞增殖活性(P＜0.01)，濃度為200 mg/L時，增殖促進(jìn)作用達(dá)最大，濃度至800 mg/L時，SaOS-2細(xì)胞的增殖被明顯抑制(P＜0.01)。三七水提物濃度在1～400 mg/L時對SaOS-2細(xì)胞增殖活性無明顯影響(P＞0.05)，濃度至800 mg/L時，SaOS-2細(xì)胞的增殖被明顯抑制(P＜0.01)。見表1。

表1 骨康膠囊組方中續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞增殖的影響( ± s，n=5)Tab.1 The Effects of Dipsacus asper，Panaxnotoginseng and Musa basjoo Sieb on Saos-2 proliferation

表1 骨康膠囊組方中續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞增殖的影響( ± s，n=5)Tab.1 The Effects of Dipsacus asper，Panaxnotoginseng and Musa basjoo Sieb on Saos-2 proliferation

(1)與對照組比較，P＜0.01

組別 細(xì)胞增殖(%)續(xù)斷 芭蕉根 三七對照組100.00±0.53 100.00±0.53 100.00±0.53 1 mg/L組 99.88±0.33 99.99±0.75 101.54±0.98 10 mg/L組 106.00±0.64(1)100.01±0.15 98.35±0.74 100 mg/L組 115.431±0.67(1)100.01±0.51 99.88±0.57 200 mg/L組 118.39±0.56(1)98.89±0.46 101.78±0.74 400 mg/L組 105.39±0.56(1)100.09±0.67 99.03±0.66 800 mg/L組 94.11±0.65(1)97.01±0.53 91.78±0.74(1)

2.2 SaOS-2細(xì)胞ALP活性

由MTT檢測結(jié)果可知，續(xù)斷及三七水提物組SaOS-2細(xì)胞的增殖隨著藥物濃度的增大而受到明顯抑制，故以10、100和200 mg/L為各實驗組的低、中、高濃度，檢測SaOS-2細(xì)胞 ALP活性，結(jié)果顯示，與對照組比較，續(xù)斷水提物組的低、中、高濃度能提高ALP水平(P＜0.05或P＜0.01)，芭蕉根、三七水提物的低、中、高濃度對 SaOS-2細(xì)胞ALP水平無明顯影響(P＞0.05)。見圖1。

圖1 骨康膠囊組方中不同濃度續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞ALP活性的影響Fig.1 The Effects of Dipsacus asper，Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on ALP activity of Saos-2 proliferation

2.3 SaOS-2細(xì)胞Ca2+和OTC

Ca2+檢測結(jié)果表明，與對照組比較，各濃度的續(xù)斷水提物對SaOS-2細(xì)胞Ca2+的分泌有非常明顯的促進(jìn)作用(P＜0.01)，芭蕉根、三七水提物的低、中、高濃度對SaOS-2細(xì)胞鈣離子分泌均無明顯影響(P＞0.05)，見表2。OTC檢測結(jié)果表明，與對照組比較，續(xù)斷水提物低濃度組對SaOS-2細(xì)胞OTC分泌無明顯影響，中、高濃度組可增加SaOS-2細(xì)胞OTC分泌(P＜0.05或P＜0.01);三七水提物低、中濃度組對OTC分泌無明顯影響，高濃度有明顯促進(jìn)OTC分泌的作用(P＜0.05);芭蕉根水提物各濃度對OTC分泌無明顯變化，見表3。

表2 骨康膠囊組方中不同濃度續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞Ca2+分泌的影響( ± s，n=5)Tab.2 The Effects of Dipsacus asper，Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion

表2 骨康膠囊組方中不同濃度續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞Ca2+分泌的影響( ± s，n=5)Tab.2 The Effects of Dipsacus asper，Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion

(1)與對照組比較，P＜0.01

組別 Ca2+(μg/L)續(xù)斷 芭蕉根 三七對照組25.25±1.47 25.25±1.47 25.25±1.47 10 mg/L組 80.59±6.97(1)23.81±2.75 25.49±2.73 100 mg/L組 178.66±6.43(1)24.15±1.67 26.11±2.41 200 mg/L組 140.72±5.81(1)26.04±1.98 28.26±3.10

表3 骨康膠囊組方中不同濃度續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞OTC分泌的影響( ± s，n=5)Tab.3 The Effects of Dipsacus asper，Panaxnotoginseng and Musa basjoo Sieb on OTC secretion

與對照組比較，(1)P＜0.05，(2)P＜0.01

組別 OTC(μg/L)續(xù)斷 芭蕉根 三七對照組11.41±0.63 11.41±0.63 11.41±0.63 10 mg/L組 13.58±0.75 10.98±0.63 11.50±0.49 100 mg/L組 14.58±0.69(1)11.78±0.57 12.36±0.61 200 mg/L組 15.32±0.76(2)12.78±0.48 14.29±0.44(1)

2.4 SaOS-2細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)

培養(yǎng)2周后，各給藥組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果呈陽性。與對照組比較，續(xù)斷水提物中、高濃度組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)目明顯高于對照組(P＜0.05)，而續(xù)斷水提物低濃度組和三七、芭蕉根水提物的各濃度組對礦化結(jié)節(jié)數(shù)目形成無明顯影響(P＞0.05)。見表4。

表4 骨康膠囊組方中不同濃度續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響( ± s，n=5)Tab.4 The Effects of Dipsacus asper，Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion

表4 骨康膠囊組方中不同濃度續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響( ± s，n=5)Tab.4 The Effects of Dipsacus asper，Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion

(1)與對照組比較，P＜0.05

組別 礦化結(jié)節(jié)數(shù)(n)續(xù)斷 芭蕉根 三七對照組4.20±0.60 4.20±0.60 4.20±0.60 10 mg/L 6.08±0.49 3.80±0.36 5.50±0.66 100 mg/L 8.92±0.58(1) 4.80±0.55 4.36±0.45 200 mg/L 10.10±0.37(1)3.91±0.46 6.00±0.74

3 討論

中藥復(fù)方是傳統(tǒng)中醫(yī)樸素的系統(tǒng)思想的產(chǎn)物，通過不同藥物之間的配伍產(chǎn)生不同的療效，且各藥物的劑量不同，也有可能會表現(xiàn)出不同的藥效。因此，在組方優(yōu)化過程中，探明復(fù)方藥物中某一藥效起作用的主要藥物顯得尤為重要。

MTT法表明，在濃度小于800 mg/L時，續(xù)斷水提物對成骨細(xì)胞增殖有很明顯的促進(jìn)作用，而芭蕉根與三七水提物作用不明顯;而較高濃度(800 mg/L)時，各給藥組SaOS-2細(xì)胞的增殖被明顯抑制，說明各給藥組高濃度對于成骨細(xì)胞可能具有一定的毒性。這可能是因為高濃度的藥材水提物中，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性的有關(guān)成分含量也有所增加。

ALP是主要分布于細(xì)胞膜的鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與細(xì)胞成熟及骨的鈣化作用密切相關(guān)，被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)成熟的早期標(biāo)志;OTC是由成骨細(xì)胞合成和分泌的一種活性多肽，是骨質(zhì)鈣化必需的因子，起到維持骨組織正常礦化的作用［8－9］。因此，ALP和OTC分別是成骨細(xì)胞早期和中期分化的標(biāo)志物［10］。與對照組比較，續(xù)斷水提物各濃度均能顯著增加ALP的活性，且能有效的促進(jìn)OTC的分泌，與程志安等［11］的研究結(jié)果一致;三七水提物除了高濃度對成骨細(xì)胞OTC的分泌有明顯的促進(jìn)作用外，其余濃度對ALP活性及OTC的分泌作用與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，而吳麗萍等［12］的研究表明三七總甙可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，這可能是由于三七水提物中的三七總甙含量不高所致。類似的，在細(xì)胞Ca2+分泌的檢測中，續(xù)斷水提物各濃度對Ca2+分泌有明顯的促進(jìn)作用，而三七、芭蕉根水提物與對照組相比無明顯差異。礦化結(jié)節(jié)的形成是成骨細(xì)胞分化的最后階段，包括膠原的沉積和基質(zhì)的礦化兩個步驟。被認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化成熟的晚期標(biāo)志［13］。培養(yǎng)2周后，各給藥組礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果呈陽性;與對照組比較，除芭蕉根水提物外，各組均有增加成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的趨勢。

綜上所述，骨康膠囊組方中的續(xù)斷可以顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞SaOS-2的增殖、分化和礦化。結(jié)合之前的研究，提示續(xù)斷、補(bǔ)骨脂和酢漿草可能為骨康膠囊促成骨細(xì)胞骨形成的主要作用藥物，而三七及芭蕉根在骨康膠囊抗骨質(zhì)疏松中的作用有待進(jìn)一步研究。