楊 健,李 靖,彭 瀟,董 莉,沈艷珍,李勇軍,席曉嵐**,劉 亭**
(1.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點實驗室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室,貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州貴陽 550025;3.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心,貴州貴陽 550004;4.貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司,貴州修文 550200)
成骨細(xì)胞(osteoblasts,OB)是骨組織中的重要細(xì)胞,起源于具有多向分化潛能的骨髓間質(zhì)細(xì)胞,主要作用是負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌,參與骨礦化。體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞是進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松新藥篩選和藥效學(xué)評價的重要模型[1-3]。骨康膠囊是由補(bǔ)骨脂、續(xù)斷、三七、芭蕉根、酢漿草組方而成的中藥復(fù)方制劑,治療骨質(zhì)疏松有較好療效,且補(bǔ)骨脂是治療骨質(zhì)疏松癥的常用藥物,為歷代醫(yī)家廣泛應(yīng)用于各類補(bǔ)腎健骨方,有調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)化,促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖等活性[4-5]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)骨康膠囊中的補(bǔ)骨脂和酢漿草成分對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化有促進(jìn)作用[6-7],為進(jìn)一步了解骨康膠囊的促骨形成作用機(jī)制,本實驗以骨康膠囊處方中的其他三味藥材續(xù)斷、三七和芭蕉根為研究對象,以成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化為指標(biāo),觀察組方中的單味藥材對成骨細(xì)胞SaOS-2增殖、分化和礦化的影響,為骨康膠囊的組方優(yōu)化提供參考。
1.1.1 細(xì)胞與試劑 SaOS-2人成骨肉瘤細(xì)胞株購自武漢普諾賽科技生物有限公司,McCoy’s 5a培養(yǎng)基購自上海生工生物工程股份有限公司,胎牛血清、胰蛋白酶、青-鏈霉素,購自美國Gibco公司,堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司,Triton X-100、噻唑藍(lán)(MTT)購自Solarbio公司,BCA蛋白定量試劑盒、哺乳動物蛋白抽提試劑盒均購自中國康為世紀(jì)公司,茜素紅購自sigma公司,人骨鈣素(OTC)ELISA試劑盒、人鈣離子(Ca2+)ELISA試劑盒均購自上海藍(lán)基公司。
1.1.2 儀器 EL204電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司),CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo scientific公司),TS-100F熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司),Allegra 64R冷凍高速離心機(jī)(美國Beckman公司),680型酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人成骨肉瘤細(xì)胞SaOS-2用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的McCoy's 5a培養(yǎng)基,在 37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),將細(xì)胞分為對照組及芭蕉根、續(xù)斷、三七給藥組,在SaOS-2細(xì)胞增殖實驗中,給藥組分別以1、10、100、200、400 和 800 mg/L 芭蕉根、續(xù)斷、三七作用于SaOS-2細(xì)胞,對照組加入不含藥培養(yǎng)基。
1.2.2 藥物配制 芭蕉根、續(xù)斷、三七提取物由貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司提供,用DMSO配制成含芭蕉根、續(xù)斷、三七生藥量為1 g/mL的溶液,于-20℃保存?zhèn)溆?,實驗時用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)的終濃度(DMSO含量小于5‰)。
1.2.3 SaOS-2細(xì)胞增殖檢測 采用MTT法。取對數(shù)生長期各組SaOS-2細(xì)胞接種于96孔板,1×104個/孔,每組5孔,培養(yǎng)24 h后換液;繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,加入MTT液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄去培養(yǎng)液后加DMSO 100μL/孔,于490 nm波長檢測各組吸光度值。
1.2.4 SaOS-2細(xì)胞ALP活性測定 取對數(shù)生長期的SaOS-2細(xì)胞接種于24孔板,10×104個/孔。培養(yǎng)24 h后,各給藥組更換為含生藥濃度的終濃度分別為10、100及200 mg/L的培養(yǎng)基,對照組為不含藥培養(yǎng)基,每個濃度5孔;繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,棄上清培養(yǎng)液,培養(yǎng)板用PBS清洗2遍,每孔加入200 μL 0.1%Triton X-100,于冰上裂解10 min,取上清液,用ALP試劑盒測定細(xì)胞ALP活性,并用BCA試劑盒測定細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)含量。用堿性磷酸酶/蛋白總濃度表示ALP的活性。
1.2.5 SaOS-2細(xì)胞Ca2+和OTC檢測 采用ELISA法。取對數(shù)生長期的SaOS-2細(xì)胞接種于24孔板,10×104個/孔;培養(yǎng)24 h后,更換為各組含藥培養(yǎng)基,藥物濃度同1.2.5,每組5孔;培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液,用PBS洗滌2次,加入哺乳動物蛋白抽提試劑200μL,冰浴10 min。取上清液按人鈣離子ELISA試劑盒和人骨鈣素ELISA試劑盒說明分別測定細(xì)胞Ca2+和OTC含量。
1.2.6 SaOS-2細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)測定 采用茜素紅染色法。取對數(shù)生長期的SaOS-2細(xì)胞接種于24孔板,30×104個/孔,培養(yǎng)24 h后,更換為各組含藥培養(yǎng)基,藥物濃度同1.2.5,每組5孔,隔天更換一次培養(yǎng)基,連續(xù)觀察2周,待形成大量的礦化結(jié)節(jié)后,棄培養(yǎng)液,加PBS清洗2遍,95%乙醇固定10 min,蒸餾水洗滌3次后,加pH 8.3的0.1%茜素紅-Tris-HcL染色30 min,蒸餾水洗滌、干燥,最后于顯微鏡下觀察各孔礦化結(jié)節(jié)的數(shù)目。
所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
與對照組比較,芭蕉根水提物濃度在1~800 mg/L時SaOS-2細(xì)胞增殖活性無明顯變化(P>0.05)。續(xù)斷水提物濃度在10~200 mg/L時能顯著增高SaOS-2細(xì)胞增殖活性(P<0.01),濃度為200 mg/L時,增殖促進(jìn)作用達(dá)最大,濃度至800 mg/L時,SaOS-2細(xì)胞的增殖被明顯抑制(P<0.01)。三七水提物濃度在1~400 mg/L時對SaOS-2細(xì)胞增殖活性無明顯影響(P>0.05),濃度至800 mg/L時,SaOS-2細(xì)胞的增殖被明顯抑制(P<0.01)。見表1。
表1 骨康膠囊組方中續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞增殖的影響( ± s,n=5)Tab.1 The Effects of Dipsacus asper,Panaxnotoginseng and Musa basjoo Sieb on Saos-2 proliferation
表1 骨康膠囊組方中續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞增殖的影響( ± s,n=5)Tab.1 The Effects of Dipsacus asper,Panaxnotoginseng and Musa basjoo Sieb on Saos-2 proliferation
(1)與對照組比較,P<0.01
組別 細(xì)胞增殖(%)續(xù)斷 芭蕉根 三七對照組100.00±0.53 100.00±0.53 100.00±0.53 1 mg/L組 99.88±0.33 99.99±0.75 101.54±0.98 10 mg/L組 106.00±0.64(1)100.01±0.15 98.35±0.74 100 mg/L組 115.431±0.67(1)100.01±0.51 99.88±0.57 200 mg/L組 118.39±0.56(1)98.89±0.46 101.78±0.74 400 mg/L組 105.39±0.56(1)100.09±0.67 99.03±0.66 800 mg/L組 94.11±0.65(1)97.01±0.53 91.78±0.74(1)
由MTT檢測結(jié)果可知,續(xù)斷及三七水提物組SaOS-2細(xì)胞的增殖隨著藥物濃度的增大而受到明顯抑制,故以10、100和200 mg/L為各實驗組的低、中、高濃度,檢測SaOS-2細(xì)胞 ALP活性,結(jié)果顯示,與對照組比較,續(xù)斷水提物組的低、中、高濃度能提高ALP水平(P<0.05或P<0.01),芭蕉根、三七水提物的低、中、高濃度對 SaOS-2細(xì)胞ALP水平無明顯影響(P>0.05)。見圖1。
圖1 骨康膠囊組方中不同濃度續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞ALP活性的影響Fig.1 The Effects of Dipsacus asper,Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on ALP activity of Saos-2 proliferation
Ca2+檢測結(jié)果表明,與對照組比較,各濃度的續(xù)斷水提物對SaOS-2細(xì)胞Ca2+的分泌有非常明顯的促進(jìn)作用(P<0.01),芭蕉根、三七水提物的低、中、高濃度對SaOS-2細(xì)胞鈣離子分泌均無明顯影響(P>0.05),見表2。OTC檢測結(jié)果表明,與對照組比較,續(xù)斷水提物低濃度組對SaOS-2細(xì)胞OTC分泌無明顯影響,中、高濃度組可增加SaOS-2細(xì)胞OTC分泌(P<0.05或P<0.01);三七水提物低、中濃度組對OTC分泌無明顯影響,高濃度有明顯促進(jìn)OTC分泌的作用(P<0.05);芭蕉根水提物各濃度對OTC分泌無明顯變化,見表3。
表2 骨康膠囊組方中不同濃度續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞Ca2+分泌的影響( ± s,n=5)Tab.2 The Effects of Dipsacus asper,Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion
表2 骨康膠囊組方中不同濃度續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞Ca2+分泌的影響( ± s,n=5)Tab.2 The Effects of Dipsacus asper,Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion
(1)與對照組比較,P<0.01
組別 Ca2+(μg/L)續(xù)斷 芭蕉根 三七對照組25.25±1.47 25.25±1.47 25.25±1.47 10 mg/L組 80.59±6.97(1)23.81±2.75 25.49±2.73 100 mg/L組 178.66±6.43(1)24.15±1.67 26.11±2.41 200 mg/L組 140.72±5.81(1)26.04±1.98 28.26±3.10
表3 骨康膠囊組方中不同濃度續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞OTC分泌的影響( ± s,n=5)Tab.3 The Effects of Dipsacus asper,Panaxnotoginseng and Musa basjoo Sieb on OTC secretion
與對照組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01
組別 OTC(μg/L)續(xù)斷 芭蕉根 三七對照組11.41±0.63 11.41±0.63 11.41±0.63 10 mg/L組 13.58±0.75 10.98±0.63 11.50±0.49 100 mg/L組 14.58±0.69(1)11.78±0.57 12.36±0.61 200 mg/L組 15.32±0.76(2)12.78±0.48 14.29±0.44(1)
培養(yǎng)2周后,各給藥組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果呈陽性。與對照組比較,續(xù)斷水提物中、高濃度組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)目明顯高于對照組(P<0.05),而續(xù)斷水提物低濃度組和三七、芭蕉根水提物的各濃度組對礦化結(jié)節(jié)數(shù)目形成無明顯影響(P>0.05)。見表4。
表4 骨康膠囊組方中不同濃度續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響( ± s,n=5)Tab.4 The Effects of Dipsacus asper,Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion
表4 骨康膠囊組方中不同濃度續(xù)斷、芭蕉根及三七對SaOS-2細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響( ± s,n=5)Tab.4 The Effects of Dipsacus asper,Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion
(1)與對照組比較,P<0.05
組別 礦化結(jié)節(jié)數(shù)(n)續(xù)斷 芭蕉根 三七對照組4.20±0.60 4.20±0.60 4.20±0.60 10 mg/L 6.08±0.49 3.80±0.36 5.50±0.66 100 mg/L 8.92±0.58(1) 4.80±0.55 4.36±0.45 200 mg/L 10.10±0.37(1)3.91±0.46 6.00±0.74
中藥復(fù)方是傳統(tǒng)中醫(yī)樸素的系統(tǒng)思想的產(chǎn)物,通過不同藥物之間的配伍產(chǎn)生不同的療效,且各藥物的劑量不同,也有可能會表現(xiàn)出不同的藥效。因此,在組方優(yōu)化過程中,探明復(fù)方藥物中某一藥效起作用的主要藥物顯得尤為重要。
MTT法表明,在濃度小于800 mg/L時,續(xù)斷水提物對成骨細(xì)胞增殖有很明顯的促進(jìn)作用,而芭蕉根與三七水提物作用不明顯;而較高濃度(800 mg/L)時,各給藥組SaOS-2細(xì)胞的增殖被明顯抑制,說明各給藥組高濃度對于成骨細(xì)胞可能具有一定的毒性。這可能是因為高濃度的藥材水提物中,對細(xì)胞產(chǎn)生毒性的有關(guān)成分含量也有所增加。
ALP是主要分布于細(xì)胞膜的鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,與細(xì)胞成熟及骨的鈣化作用密切相關(guān),被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)成熟的早期標(biāo)志;OTC是由成骨細(xì)胞合成和分泌的一種活性多肽,是骨質(zhì)鈣化必需的因子,起到維持骨組織正常礦化的作用[8-9]。因此,ALP和OTC分別是成骨細(xì)胞早期和中期分化的標(biāo)志物[10]。與對照組比較,續(xù)斷水提物各濃度均能顯著增加ALP的活性,且能有效的促進(jìn)OTC的分泌,與程志安等[11]的研究結(jié)果一致;三七水提物除了高濃度對成骨細(xì)胞OTC的分泌有明顯的促進(jìn)作用外,其余濃度對ALP活性及OTC的分泌作用與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,而吳麗萍等[12]的研究表明三七總甙可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化,這可能是由于三七水提物中的三七總甙含量不高所致。類似的,在細(xì)胞Ca2+分泌的檢測中,續(xù)斷水提物各濃度對Ca2+分泌有明顯的促進(jìn)作用,而三七、芭蕉根水提物與對照組相比無明顯差異。礦化結(jié)節(jié)的形成是成骨細(xì)胞分化的最后階段,包括膠原的沉積和基質(zhì)的礦化兩個步驟。被認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化成熟的晚期標(biāo)志[13]。培養(yǎng)2周后,各給藥組礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果呈陽性;與對照組比較,除芭蕉根水提物外,各組均有增加成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的趨勢。
綜上所述,骨康膠囊組方中的續(xù)斷可以顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞SaOS-2的增殖、分化和礦化。結(jié)合之前的研究,提示續(xù)斷、補(bǔ)骨脂和酢漿草可能為骨康膠囊促成骨細(xì)胞骨形成的主要作用藥物,而三七及芭蕉根在骨康膠囊抗骨質(zhì)疏松中的作用有待進(jìn)一步研究。