劉建春 ，張紅珍 ，郭文娟 ，柴 智 ，尉杰忠 ，于婧文 ，肖保國 ，馬存根 ，

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西晉中030619； 2.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西大同 037009；3.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海200025）

多發(fā)性硬化（Multiple sclerosis，MS）是一種發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的自身免疫性疾?。?］，其主要病理特征為髓鞘脫失、軸突變性及炎性細(xì)胞浸潤?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對MS的治療手段主要包括抗炎和免疫調(diào)節(jié)兩方面，然而MS病程遷延、病情反復(fù)發(fā)作，多不能得到有效的控制，且有些藥物不良反應(yīng)較大［1-2］。中醫(yī)藥在治療MS方面以多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)為切入點(diǎn)，可能比單一作用靶點(diǎn)的西藥更具優(yōu)勢［3］。在臨床上，應(yīng)用中醫(yī)藥的方法治療MS一方面可改善患者臨床癥狀、減緩疾病的復(fù)發(fā)，另一方面還可減少激素不良反應(yīng)等［4］。

中醫(yī)認(rèn)為，MS基本病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，血瘀是其中較為特殊的一個證候要素［5］。氣虛血瘀證為常見證型之一，治療應(yīng)以補(bǔ)氣，活血，祛痰、濕、瘀，通絡(luò)為主。清代著名醫(yī)家王清任所創(chuàng)的補(bǔ)陽還五湯（BYHWD）是益氣活血的代表方劑，具有補(bǔ)氣活血通絡(luò)之功效，由生黃芪四兩、當(dāng)歸尾二錢，赤芍一錢半，川芎一錢，地龍一錢，桃仁一錢，紅花一錢組成［6-8］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)BYHWD治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）可明顯改善臨床癥狀，抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫［9］。本研究以 MS的經(jīng)典動物模型EAE小鼠為研究對象，進(jìn)一步探討補(bǔ)陽還五湯在疾病潛伏期、發(fā)病高峰期、疾病緩解期這3個時(shí)間點(diǎn)對EAE的血腦屏障（BBB）保護(hù)的機(jī)制，以期為臨床有效防治多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級C57BL/6雌性小鼠，8～10 w齡，共36只，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司［許可證號：SCXK（京）2016-0006］。實(shí)驗(yàn)前小鼠自由飲食喂養(yǎng)1 w，飼養(yǎng)環(huán)境為25℃左右的無病原菌清潔級動物房。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 補(bǔ)陽還五湯為《醫(yī)林改錯》的原方劑量，藥材購自北京同仁堂藥店。弗氏佐劑（Freund，sAdjuvant，Complete） 購自美國 Sigma 公司；上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成的MOG 35-55多肽（myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide）；Tuberculosis bacilli（TB）購自美國DIFCO公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自BioVision。ZO-1，Occludin均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。凝膠電泳設(shè)備，北京六一儀器廠產(chǎn)品，凝膠成像分析儀購自Bio-Rad，冰凍LEICA切片機(jī)，CM1950，購自德國LEICA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EAE小鼠模型建立 分別稱取12 mg TB加入2 mL完全弗氏佐劑，稱取10 mg MOG35-55加入2 mL生理鹽水中；采用自制的針管混合器來回反復(fù)推動使兩種溶液充分混合，制成油包水樣乳白色抗原乳劑。每只小鼠分4點(diǎn)皮下注射抗原乳劑0.1 mL，注射位置在背側(cè)腰骶膨大處背部中線兩側(cè)［10］。將免疫當(dāng)天記為免疫后第0天。在免疫當(dāng)日和免疫后第2天，分別給每只小鼠腹腔注射百日咳毒素（PTX）300 ng。免疫動物開始相繼出現(xiàn)臨床癥狀是在免疫后的第10天左右，在14～17 d進(jìn)入高峰期，本次實(shí)驗(yàn)小鼠全部發(fā)病，且無死亡［11］。

1.2.2 補(bǔ)陽還五湯的制備 藥物按常規(guī)中藥煎煮方法，藥物在水中浸泡2 h，煎煮1 h，紗布過濾，渣滓再加適量水煎煮30 min，過濾，二次濾液合并，靜置過夜；次日將藥液沉淀過濾掉，將濾液濃縮至80 mL，相當(dāng)于生藥2 g/mL，常溫下冷卻，分裝，4℃冷藏備用。

1.2.3 動物分組及用藥 應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表按體質(zhì)量分層，將36只8～10 w齡雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為EAE組、BYHWD組，每組18只。每組小鼠于免疫后第3天開始灌胃給藥，EAE組每只小鼠灌胃生理鹽水500 μL/d，BYHWD組每只小鼠予以BYHWD 500 μL/d，持續(xù)給藥至免疫 28 d。

1.2.4 EAE臨床癥狀評分 采用國際通用的5分法［12］，在免疫后第0天開始隔天定時(shí)觀察及評估實(shí)驗(yàn)小鼠的癥狀，評估標(biāo)準(zhǔn)為：無任何臨床癥狀記0分；輕度步態(tài)笨拙，尾部張力消失記 1分；步態(tài)蹣跚，單側(cè)后下肢無力，被動翻身后仍可以復(fù)位記2分；雙后肢癱瘓，但給予刺激后可以挪動，被動翻身后不能恢復(fù)記3分；前肢和雙側(cè)后肢癱瘓記4分；瀕臨死亡或死亡記5分。癥狀介于兩個評分標(biāo)準(zhǔn)之間，以±0.5 分計(jì)。

1.2.5 標(biāo)本采集 將免疫后第9天記為疾病潛伏期，第17天記為發(fā)病高峰期，第28天記為緩解期。在免疫后第9天、第17天、第28天3個不同時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)取EAE組和BYHWD組6只小鼠，采用 10%水合氯醛（0.2 mL/只）腹腔注射麻醉，每組取3只推注PBS進(jìn)行心臟灌注，同時(shí)在冰上快速取小鼠脊髓和腦組織，冰上裂解，4℃離心提取蛋白，凍存。各組其余3只小鼠推注PBS至肝臟發(fā)白，再推注4%多聚甲醛進(jìn)行體內(nèi)組織固定。然后分離脊髓和腦，制作冷凍切片，冰切厚度10 μm，進(jìn)行固藍(lán)染色和HE染色。

1.2.6 HE染色 將脊髓冰凍切片在蒸餾水中浸潤，按照說明書在切片上分別滴加蘇木精和伊紅染色，梯度乙醇脫水，70%乙醇中 30 s，80%乙醇中 30 s，90%乙醇中 30 s，95%乙醇中 30 s，100%乙醇中 1 min，100%乙醇中 2 min；二甲苯透明，用中性樹膠封片，鏡檢，拍照。

1.2.7 固藍(lán)染色 取脊髓切片于 95% 乙醇中浸泡，按照說明書的操作步驟，將切片浸于固藍(lán)液中，57℃ 孵育24 h，分別經(jīng)過乙醇溶液、去離子水、0.05%碳酸鋰浸洗直至能夠清晰辨別灰質(zhì)與白質(zhì)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，光鏡下觀察，拍照。

1.2.8 Western Blot 分別提取脊髓和腦組織蛋白，蛋白定量后，加入Buffer煮蛋白，用微量加樣器加入40 μg煮好的蛋白樣品。用 10%SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白。電泳完畢后，濕轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗一抗ZO-1（1∶500）、Occludin（1∶1000）、GADPH（1∶1000），4℃過夜；次日洗滌后，用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP 標(biāo)記二抗（1∶50 000）稀釋，使 PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，37℃搖床室溫孵育2 h。洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用Bio-RAD凝膠成像儀檢測條帶，用Band Scan分析灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值比較，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph Pad Prism5.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Western blot灰度值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較使用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EAE組和BYHWD組臨床癥狀比較

EAE組小鼠自免疫后第9天起逐步發(fā)病，精神萎靡、食欲減退，平均起病時(shí)間（10.6±1.32）d，平均最高臨床評分為（3.4±0.22）分。免疫后 17 d 發(fā)展為臀部拖地，后肢癱瘓，此時(shí)，最高臨床癥狀評分可達(dá) 4.5分。補(bǔ)陽還五湯組平均起病時(shí)間（12.6±0.7）d，臨床癥狀評分為（1.55±0.39）分。兩組平均起病時(shí)間比較，t=3.45，P=0.003 2，補(bǔ)陽還五湯可明顯延遲發(fā)?。粌山M平均最高臨床評分比較，t=14，P=0.000 1，補(bǔ)陽還五湯可明顯延遲發(fā)病，降低EAE臨床評分。結(jié)果見圖1。

2.2 EAE組和BYHWD組脊髓炎性細(xì)胞浸潤和髓鞘脫失情況比較

2.2.1 HE染色 BYHWD抑制脊髓炎性細(xì)胞浸潤。在EAE疾病潛伏期：EAE組9 d小鼠的脊髓組織中發(fā)現(xiàn)少數(shù)炎細(xì)胞浸潤；BYHWD組9 d小鼠的脊髓組織中無炎細(xì)胞浸潤。在EAE發(fā)病高峰期：EAE組17 d小鼠的脊髓組織中出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤；BYHWD組17 d小鼠的脊髓切面結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯炎細(xì)胞浸潤。在EAE發(fā)病緩解期：EAE組28 d小鼠的脊髓組織中炎細(xì)胞浸潤減少；BYHWD組28 d小鼠的脊髓組織中無明顯炎細(xì)胞浸潤。結(jié)果見圖2。

圖2 免疫后第9天、第17天和第28天脊髓HE染色

2.2.2 LFB染色 BYHWD可減少脊髓的髓鞘脫失面積。疾病潛伏期：EAE9 d組中小鼠的脊髓白質(zhì)較BYHWD9 d組結(jié)構(gòu)疏松；發(fā)病高峰期和發(fā)病緩解期：分別EAE17 d組、EAE28 d組比較，BYHWD17 d組、BYHWD28 d組小鼠的脊髓白質(zhì)中髓鞘脫失面積較少。結(jié)果見圖3。

2.2.3 EAE組和 BYHWD組緊密連接蛋白表達(dá)比較 Western Blot法檢測小鼠脊髓和腦中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對應(yīng)的EAE17 d和EAE28 d相比較，BYHWD9 d、17 d和28 d ZO-1在脊髓和腦中表達(dá)量均明顯上調(diào)（P＜0.001）（圖 4、圖 5）；與對應(yīng)的 EAE9 d、EAE17 d和 EAE28 d相比較，BYHWD9 d、17 d和 28 d Occludin 在脊髓中表達(dá)量均明顯上調(diào)（P＜0.001），與對應(yīng)的EAE9 d、EAE17 d組小鼠比較，BYHWD9 d、BYHWD17 d在腦中 Occludin 高表達(dá)（P＜0.001），BYHWD28 d組與EAE28 d組比較表達(dá)增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖4、圖5。

圖3 免疫后第9天、第17天和第28天脊髓LFB染色

圖4 EAE組和BYHWD組緊密連接蛋白在脊髓的表達(dá)

3 討論

血液和腦組織之間存在血腦屏障（Blood brain barrier，BBB），其由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞突起的腳板構(gòu)成［13］。腦的毛細(xì)血管屬連續(xù)毛細(xì)血管，內(nèi)皮細(xì)胞之間有緊密連接，可以阻止血液中的一些物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到中樞，從而保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［14］。因此，維持BBB結(jié)構(gòu)的完整性是嚴(yán)格控制大腦化學(xué)成分的關(guān)鍵，是神經(jīng)組織發(fā)揮正常功能的重要前提之一。BBB的破壞導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增加，使血源中有毒的分子、細(xì)胞和微生物制劑進(jìn)入大腦，它能啟動多種神經(jīng)變性途徑［15-16］。

圖5 EAE組和BYHWD組緊密連接蛋白在腦的表達(dá)

多發(fā)性硬化（MS）是一種由 CD4+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性脫髓鞘疾病。BBB完整性的破壞在 MS/EAE發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。目前已證實(shí)，在MS患者腦中除了外周血巨噬細(xì)胞浸潤外，還發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的大量涌入，這表明BBB的破壞使得循環(huán)血液中炎性細(xì)胞穿過BBB浸潤到中樞神經(jīng)系統(tǒng)［17］，導(dǎo)致了一系列免疫反應(yīng)，破壞神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，造成局部脫髓鞘和神經(jīng)變性［1，18］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，EAE9 d小鼠的脊髓組織中發(fā)現(xiàn)少數(shù)炎細(xì)胞浸潤，說明在EAE發(fā)病的最早階段就有BBB通透性增加，在EAE發(fā)病高峰期17 d小鼠的脊髓組織中出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤，而BYHWD17 d組小鼠的脊髓切面結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯炎細(xì)胞浸潤。與 EAE17 d、EAE28 d 比較，BYHWD17 d、BYHWD28 d組小鼠的脊髓白質(zhì)中髓鞘脫失面積較少。這些結(jié)果說明BYHWD可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤，減輕髓鞘脫失。

腦血管內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞之間的緊密連接是保持血腦屏障的重要因素［19］。緊密連接蛋白主要包括胞質(zhì)蛋白 ZO-1和跨膜蛋白 Occludin、Claudins等。其中，ZO-1是非常重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在緊密連接中起著重要的連接樞紐作用，它將跨膜蛋白與細(xì)胞骨架、結(jié)構(gòu)蛋白聯(lián)系；ZO-1表達(dá)水平及活性的高低與緊密連接結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和細(xì)胞功能的完整性密切相關(guān)，ZO-1表達(dá)水平的高低可以作為BBB功能的標(biāo)志［14-15］。體外、體內(nèi)動物模型和患者組織研究的觀察結(jié)果表明，在MS病理學(xué)中，血腦屏障完整性和功能的破壞程度很高［20］。與正常結(jié)構(gòu)的白質(zhì)相比，在MS病變中，內(nèi)皮變性，緊密連接蛋白ZO-1不連續(xù)地表達(dá)［21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對應(yīng)的EAE9 d、17 d和 28 d相比較，BYHWD 9 d、17 d和 28 d組，ZO-1 在脊髓和腦中表達(dá)量均顯著上調(diào)，Occluudin在脊髓中表達(dá)量均顯著上調(diào)，表明BYHWD在EAE疾病潛伏期、疾病高峰期和緩解期能通過上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1和Occluudin的表達(dá)，抑制血腦屏障的破壞，抑制中樞炎性浸潤，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。