尤翔宇，黃慧敏，吳曉娟，吳 偉*

（稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

米糠是稻谷籽粒的精華所在，雖然只占稻谷質(zhì)量的6%～8%，卻集中了64%的稻谷營養(yǎng)素和90%以上的人體必需元素[1]。米糠中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為11%～17%，米糠蛋白過敏性低，氨基酸組成合理，生物效價(jià)高，特別適合開發(fā)嬰幼兒配方食品[2]。米糠蛋白還具有良好的溶解性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)，是一種極具開發(fā)潛力的植物蛋白[3-4]。米糠中含有12%～22%油脂以及活性較強(qiáng)的脂肪水解酶和脂肪氧合酶，在米糠貯藏和加工過程中，脂肪水解酶可快速水解米糠油形成游離脂肪酸，使得米糠快速水解酸敗；形成的游離多不飽和脂肪酸在米糠內(nèi)源脂肪氧合酶的作用下發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致米糠氧化酸敗[5-6]。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)較為復(fù)雜，其中活性物質(zhì)主要包括脂質(zhì)自由基和活性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物[7]，這些活性物質(zhì)具有氧化米糠蛋白的能力，在米糠貯藏過程中可導(dǎo)致米糠蛋白結(jié)構(gòu)[8]、功能性質(zhì)[9]和消化性質(zhì)[10]發(fā)生劇烈變化，但目前尚不清楚脂質(zhì)自由基和活性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物分別對米糠蛋白氧化造成多大程度的影響。已有研究表明，2,2’-鹽酸脒基丙烷（2,2’-azobis(2-amidinopropane)，AAPH）有氧熱分解產(chǎn)生的過氧自由基是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中最主要的自由基中間體[11]。Wu Wei[12]和Ye Lin[13]等分別采用AAPH在有氧條件下熱降解產(chǎn)生的過氧自由基氧化大豆蛋白和花生蛋白，均發(fā)現(xiàn)過氧自由基會對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)產(chǎn)生重要影響，但目前還鮮見過氧自由基氧化米糠蛋白的研究報(bào)道。因此，本研究采用AAPH在有氧條件下熱降解產(chǎn)生的過氧自由基代表米糠氧化酸敗中產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基，研究脂質(zhì)自由基氧化對米糠蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響，以期更深入地了解米糠蛋白的氧化機(jī)理，為合理開發(fā)米糠蛋白提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮米糠 湖南長沙霞凝國家糧食儲備庫。

AAPH（純度97%） 上海Macklin公司；5,5’-二硫代二硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、1-苯氨基萘-8-磺酸（均為分析純） 美國S i g m a-A l d r i c h公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）、甘氨酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sorvall LYNX 6000高速落地離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司；FD5-4冷凍干燥機(jī) 美國GOLD-SIM公司；IRTracer-100傅里葉紅外光譜儀、LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；F4600熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；Healthcare SE260電泳儀 美國GE公司；Nano ZS納米粒度分析儀 英國Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白提取

參考吳偉等[8]方法提取米糠蛋白。新鮮米糠除雜過40 目篩，隨后與正己烷以料液比1∶5（g/mL）混合脫脂，重復(fù)脫脂5 次。將脫脂米糠和去離子水以1∶10（g/mL）混合，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，40 ℃、120 r/min攪拌提取4 h，隨后4 ℃、8 000 r/min離心20 min，取上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至4.0，靜置20 min后，4 ℃、8 000 r/min離心20 min得到米糠蛋白沉淀，去離子水洗滌3 次后將蛋白沉淀分散于5 倍體積的去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，采用截留分子質(zhì)量3 500 u的透析袋透析24 h脫鹽，最后冷凍干燥得到純度為83.75%的米糠蛋白。

1.3.2 過氧自由基氧化米糠蛋白制備

參考Wu Wei等[12]的方法制備過氧自由基氧化米糠蛋白。將米糠蛋白分散于0.01 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（含有0.5 mg/mL NaN3）中，配制成蛋白質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液。將一定質(zhì)量的AAPH溶解于米糠蛋白溶液中，使得AAPH濃度分別為0、0.1、1、3、6 mmo1/L和10 mmo1/L，然后將混合液在37 ℃避光條件下恒溫水浴攪拌振蕩反應(yīng)24 h。隨后將溶液置于冰浴中降溫至4 ℃以下，再將溶液在4 ℃去離子水中采用截留分子質(zhì)量3 500 u的透析袋透析24 h除去殘余未反應(yīng)的AAPH，最后冷凍干燥得到過氧自由基氧化米糠蛋白，將其置于4 ℃條件下貯存待用。

1.3.3 米糠蛋白羰基含量測定

參考Sun Weizheng等[14]的方法測定氧化米糠蛋白羰基含量。將0.50 g氧化米糠蛋白溶于25 mL 0.05 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中，采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定溶液中蛋白質(zhì)含量。取0.35 mL蛋白質(zhì)溶液和1 mL 2 mol/L的HCl溶液（含10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼）混合，同時(shí)以不加2,4-二硝基苯肼為空白對照，20 ℃水浴2 h后加入0.45 mL 40%三氯乙酸溶液，混勻后靜置0.5 h，然后4 ℃、10 000 r/min離心20 min，將沉淀加入到1.5 mL乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）混合溶液中，在4 ℃、10 000 r/min 離心20 min，洗滌沉淀3 次，隨后將沉淀溶解于1.0 mL 0.1 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液（含6 mol/L鹽酸胍）中，37 ℃水浴20 min后測定波長367 nm處吸光度，以摩爾消光系數(shù)22 000 L/（mol?cm）計(jì)算每毫克蛋白質(zhì)中羰基含量。

1.3.4 米糠蛋白游離巰基和二硫鍵含量測定

采用DTNB比色法測定米糠蛋白的游離巰基和二硫鍵含量[12]。將0.25 g氧化米糠蛋白溶于50 mL 8 mol/L尿素Tris-Gly溶液中，采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定溶液中蛋白質(zhì)含量。取4 mL蛋白質(zhì)溶液加入160 μL含4 mg/mL DNTB的pH 8.0的Tris-Gly緩沖液，以不加DNTB為對照，在412 nm波長處測定吸光度，以摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計(jì)算游離巰基含量。另取4 mL蛋白質(zhì)溶液加入0.2% β-巰基乙醇溶液處理2 h后，再加入8 mL 12%的三氯乙酸溶液沉淀蛋白質(zhì)1 h，10 000 r/min離心10 min，用三氯乙酸溶液重復(fù)洗滌沉淀3 次后，將沉淀溶于6 mL Tris-Gly緩沖液中，以不加DNTB為對照，在412 nm波長處測定吸光度，以摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol?cm）計(jì)算總巰基含量?？値€基與游離巰基差值的1/2即為二硫鍵含量。

1.3.5 米糠蛋白二酪氨酸含量測定

參考Cui Xuhai等[15]的方法測定米糠蛋白的二酪氨酸含量。將氧化米糠蛋白樣品溶于0.02 mol/L、pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中，制備1 mg/mL蛋白質(zhì)溶液，在325 nm激發(fā)波長和395 nm發(fā)射波長處測量熒光強(qiáng)度，狹縫寬度為5 nm。

1.3.6 米糠蛋白傅里葉紅外光譜分析

參考Liu Yongle等[16]的方法。在室溫、干燥環(huán)境中將2 mg氧化米糠蛋白樣品與200 mg KBr研磨混合均勻后壓片5 min制成透明薄片，采用傅里葉紅外測定儀進(jìn)行掃描。掃描波數(shù)范圍400～4 000 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描次數(shù)為64 次。

1.3.7 米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜分析

參考Wu Wei等[12]的方法對米糠蛋白進(jìn)行內(nèi)源熒光光譜分析。將氧化米糠蛋白溶解于0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定溶液中蛋白質(zhì)含量，用磷酸鹽緩沖液將蛋白質(zhì)量濃度稀釋到0.1 mg/mL。采用F-4600型熒光光譜儀在激發(fā)波長280 nm條件下掃描300～500 nm之間的發(fā)射光譜（狹縫寬度2.5，靈敏度為1），以0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液作空白。

1.3.8 米糠蛋白表面疏水性測定

采用1-苯氨基萘-8-磺酸作為熒光探針法測定米糠蛋白的表面疏水性[12]。將0.45 g氧化米糠蛋白溶于30 mL 0.05 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中，采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定溶液中蛋白質(zhì)含量，并將蛋白質(zhì)溶液稀釋為蛋白質(zhì)量濃度在0.005～0.50 mg/mL之間的5 個(gè)不同梯度。取不同質(zhì)量濃度蛋白溶液4 mL，分別加入50 μL 8 mmol/L 1-苯氨基萘-8-磺酸溶液，在激發(fā)波長390 nm、發(fā)射波長470 nm處測定熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)量濃度作圖，曲線初始階段的斜率即為米糠蛋白的表面疏水性指數(shù)。

1.3.9 米糠蛋白凝膠電泳分析

參考Wu Wei等[12]的電泳方法。濃縮膠4%，分離膠12.5%；電極緩沖液含0.1%十二烷基硫酸鈉（pH 8.3）、0.384 mol/L Gly、0.05 mol/L Tris；樣品溶解液為0.01 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，含2%十二烷基硫酸鈉、10%甘油、0.02%溴酚藍(lán)、5% β-巰基乙醇；樣品質(zhì)量濃度1.5 mg/mL，上樣量10 μL。電泳采用0.75 mm凝膠板，開始時(shí)電流為10 mA，樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)為25 mA。

1.3.10 米糠蛋白分子質(zhì)量測定

將氧化米糠蛋白分散于0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液中（pH 7.2，含0.05 mol/L NaCl），配制成蛋白質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，隨后過孔徑0.45 μm的醋酸纖維素膜，收集濾液。采用LC-20A高效液相色譜儀對樣品進(jìn)行分析。色譜柱：TSKgel SW G4000 SWXL（7.8 mm×300 mm，8 μm）；檢測器：Waters 996光電二極管陣列檢測器；流動相：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2，含0.05 mol/L NaCl）；檢測波長280 nm；流速1 mL/min；柱溫25 ℃。

1.3.11 米糠蛋白粒徑分布測定

將氧化米糠蛋白溶于0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為1 mg/mL，隨后在25 ℃條件下采用納米粒度分析儀測定米糠蛋白溶液的粒徑分布。

1.3.12 米糠蛋白持水性、持油性測定

參考Benelhadj等[17]的方法，持水性表示為吸收水的質(zhì)量占樣品的質(zhì)量的百分比，持油性表示為吸收油的質(zhì)量占樣品質(zhì)量的百分比。

1.3.13 米糠蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性測定

參考Zhu Songming等[18]的方法，氣泡能力表示為泡沫體積占溶液體積的百分比，泡沫穩(wěn)定性表示為靜置30 min后的泡沫體積占初始泡沫體積的百分比。

1.3.14 米糠蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性測定

參考Zhang等[19]的方法，在波長500 nm處測定新制備的和靜止30 min的米糠蛋白-大豆油乳狀液的吸光度，按公式（1）、（2）計(jì)算：

式中：N為稀釋倍數(shù)；C為樣品溶解液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為油相所占的體積分?jǐn)?shù)/%。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)平行測定3 次。數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件和Origin 7.5軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以表示。指標(biāo)比較采用最小顯著差異法，取95%置信度（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧自由基氧化對米糠蛋白氧化程度的影響

表1 不同濃度AAPH形成的過氧自由基氧化米糠蛋白羰基、游離巰基、二硫鍵和二酪氨酸含量Table 1 Carbonyl, free sulfhydryl, disulfide, and dityrosine contents of rice bran protein oxidatively modified by peroxyl radicals derived from different concentrations of AAPH

為研究實(shí)際的米糠酸敗程度對米糠蛋白氧化程度和結(jié)構(gòu)特征的影響，吳偉等[8]以新鮮米糠為原料，在室溫條件下貯藏不同時(shí)間得到不同酸敗程度的米糠，以制備米糠毛油的酸價(jià)作為米糠貯藏時(shí)間的選擇依據(jù)，研究發(fā)現(xiàn)新鮮米糠在室溫條件下貯藏0、1、3、5、10 d制備米糠毛油酸價(jià)分別為4.03、14.65、22.54、25.72 mg/g和30.38 mg/g（以KOH計(jì)），這些酸價(jià)數(shù)值在我國生產(chǎn)的絕大部分米糠毛油酸價(jià)范圍（15～40 mg/g）內(nèi)[20]，對應(yīng)制備的米糠蛋白羰基含量分別為1.76、2.74、4.13、5.85 nmol/mg和9.16 nmol/mg。蛋白質(zhì)羰基含量是衡量蛋白質(zhì)氧化程度最常用的指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)將新鮮米糠貯藏0、1、3、5、10 d制備米糠蛋白羰基含量與過氧自由基氧化米糠蛋白羰基含量對比，從而確定AAPH的添加濃度分別為0、0.1、1、3、6 mmo1/L和10 mmo1/L，不同濃度AAPH形成的過氧自由基氧化米糠蛋白羰基含量如表1所示，當(dāng)AAPH濃度從0 mmol/L增加到10 mmol/L時(shí)，米糠蛋白羰基含量從2.0 nmol/mg增加到7.09 nmol/mg，表明濃度逐漸增大的AAPH形成的過氧自由基導(dǎo)致米糠蛋白逐漸氧化。過氧自由基能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)主肽鏈和氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)形成蛋白質(zhì)過氧自由基，隨后通過酰胺化等途徑導(dǎo)致蛋白質(zhì)形成羰基化合物[21]。

蛋白質(zhì)巰基和酪氨酸殘基是對氧化較為敏感的基團(tuán)，但蛋白質(zhì)羰基含量不能表征蛋白質(zhì)巰基和酪氨酸殘基的氧化程度，本實(shí)驗(yàn)采用游離巰基和二硫鍵含量表征米糠蛋白巰基氧化程度，采用二酪氨酸含量表征米糠蛋白酪氨酸殘基的氧化程度，結(jié)果如表1所示，隨著AAPH濃度的增加，米糠蛋白游離巰基含量從23.97 nmol/mg逐漸減小到15.29 nmol/mg，二硫鍵含量則從12.04 nmol/mg逐漸增加到14.69 nmol/mg，二酪氨酸含量從84.54逐漸增加到127.1，表明濃度逐漸增大的AAPH形成的過氧自由基導(dǎo)致米糠蛋白巰基和酪氨酸殘基逐漸氧化。依據(jù)氧化環(huán)境和氧化強(qiáng)度的改變，過氧自由基攻擊蛋白質(zhì)巰基可發(fā)生可逆氧化反應(yīng)，也可發(fā)生不可逆氧化反應(yīng)[22-23]。過氧自由基首先與巰基反應(yīng)生成亞磺酰自由基，亞磺酰自由基隨后與分子氧形成硫醇自由基，硫醇自由基進(jìn)一步氧化形成二硫鍵，造成蛋白質(zhì)氧化程度增加[24]，這一階段是可逆氧化反應(yīng)，而不可逆氧化反應(yīng)則生成亞磺酸和磺酸等[25]。表1中游離巰基含量的下降程度明顯大于二硫鍵的增加程度，表明游離巰基既發(fā)生了可逆氧化也發(fā)生了不可逆氧化。蛋白質(zhì)酪氨酸殘基易受過氧自由基攻擊而和空間位置相鄰的酪氨酸殘基共價(jià)交聯(lián)，形成二酪氨酸[26]。

2.2 過氧自由基氧化對米糠蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

圖1 不同濃度AAPH形成的過氧自由基氧化對米糠蛋白去卷積酰胺I帶的影響Fig. 1 Effect of oxidative modification by peroxyl radicals derived from different concentrations of AAPH on the deconvolution amide I band of rice bran protein

表2 不同濃度AAPH形成的過氧自由基氧化對米糠蛋白二級結(jié)構(gòu)組成的影響Table 2 Effect of oxidative modification by peroxyl radicals derived from different concentrations of AAPH on the secondary structure composition of rice bran protein

傅里葉變換紅外光譜是表征蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)方法之一，尤其是酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1），是反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化最常用的譜帶[27]。米糠蛋白去卷積酰胺I帶譜圖如圖1所示，參考Liu Yongle等[16]的方法對譜圖進(jìn)行Gaussian擬合，分離重疊吸收峰，均得到10 個(gè)特征吸收峰，如表2所示。1 610 cm－1是由氨基酸側(cè)鏈（尤其是酪氨酸殘基等）產(chǎn)生的特征吸收峰[28]。1 618、1 628 cm－1可歸屬于蛋白質(zhì)β-折疊平行排列產(chǎn)生的特征吸收峰，而1 638、1 676、1 686 cm－1可歸屬于蛋白質(zhì)β-折疊反平行排列產(chǎn)生的特征吸收峰[29]。1 655 cm－1的強(qiáng)吸收峰通常認(rèn)為是各種蛋白質(zhì)中α-螺旋結(jié)構(gòu)的C＝O伸縮振動產(chǎn)生的[16,30]。在1 646 cm－1和1 662 cm－1的特征吸收峰可認(rèn)為是隨機(jī)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的，而1 671 cm－1的特征吸收峰可認(rèn)為是β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的[31]。結(jié)果顯示，隨著AAPH濃度增加，β-折疊結(jié)構(gòu)相對含量由36.87%上升到41.14%，而α-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量由22.54%降低到19.41%，同時(shí)無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量也由27.27%降低到24.53%。吳偉等[8]在研究新鮮米糠貯藏0、1、3、5、10 d后制備米糠蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著新鮮米糠貯藏時(shí)間的延長，米糠蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含量下降，無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量上升，與本實(shí)驗(yàn)過氧自由基氧化米糠蛋白二級結(jié)構(gòu)變化趨勢有所出入，這是由于新鮮米糠貯藏過程產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基和活性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物均可氧化修飾米糠蛋白，而本實(shí)驗(yàn)僅以過氧自由基代表脂質(zhì)自由基氧化修飾米糠蛋白。Sun Weizheng等[28]研究氧化對肌原纖維蛋白乳化性能的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，隨著氧化劑濃度的增加，肌原纖維蛋白β-折疊、α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量呈現(xiàn)出與本實(shí)驗(yàn)類似的變化趨勢，氨基酸側(cè)鏈總量呈現(xiàn)先增加后略微下降的趨勢。氨基酸側(cè)鏈含量的增加，可能是由于低濃度AAPH會誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，尤其是疏水基團(tuán)的暴露[28]；但如前所述，隨著AAPH濃度增加，酪氨酸氧化形成二酪氨酸，且暴露出的疏水基團(tuán)在氧化和疏水相互作用下形成聚集體，這都會導(dǎo)致1 610 cm－1的振動減弱，即顯著降低氨基酸側(cè)鏈的含量。

2.3 過氧自由基氧化對米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

圖2 不同濃度AAPH形成的過氧自由基氧化對米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響Fig. 2 Effect of oxidative modification by peroxyl radicals derived from different concentrations of AAPH on the intrinsic fl uorescence of rice bran protein

如圖2所示，隨著AAPH濃度的增加，最大內(nèi)源熒光強(qiáng)度從610.1下降到506.5，內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降16.98%，最大熒光峰位從349.4 nm藍(lán)移到344.4 nm。吳偉等[8]在研究新鮮米糠貯藏0、1、3、5、10 d后制備米糠蛋白的內(nèi)源熒光光譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著新鮮米糠貯藏時(shí)間的延長，米糠蛋白最大內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降13.57%，最大熒光峰位從349 nm藍(lán)移到347 nm。由此可見，過氧自由基氧化米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜變化趨勢與新鮮米糠貯藏導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化時(shí)的米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜變化趨勢較為類似。蛋白質(zhì)中色氨酸殘基具有較低的單電子氧化勢能，極易被過氧自由基氧化成為犬尿氨酸，從而降低蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光強(qiáng)度[12]。此外，內(nèi)源熒光光譜中最大熒光峰位藍(lán)移表明米糠蛋白中色氨酸殘基微環(huán)境非極性增強(qiáng)，這可能是由于過氧自由基氧化米糠蛋白形成聚集體，從而避開外部極性環(huán)境造成的[12]。

2.4 過氧自由基氧化對米糠蛋白表面疏水性的影響

圖3 不同濃度AAPH形成的過氧自由基氧化對米糠蛋白表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of oxidative modification by peroxyl radicals derived from different concentrations of AAPH on the surface hydrophobicity of rice bran protein

如圖3所示，隨著AAPH濃度的增加，米糠蛋白的表面疏水性從913.4逐漸下降到668.3。吳偉等[8]在研究新鮮米糠貯藏0、1、3、5、10 d后制備米糠蛋白的表面疏水性時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著新鮮米糠貯藏時(shí)間的延長，米糠蛋白表面疏水性由908.6逐漸下降至598.3，與本實(shí)驗(yàn)過氧自由基氧化米糠蛋白表面疏水性變化趨勢類似。Wu Wei等[12]采用過氧自由基氧化大豆蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)其表面疏水性呈現(xiàn)類似的變化趨勢，并認(rèn)為過氧自由基先誘導(dǎo)疏水側(cè)鏈的氨基酸殘基轉(zhuǎn)化為親水基團(tuán)，再隨之進(jìn)入蛋白質(zhì)內(nèi)部，誘導(dǎo)內(nèi)部氨基酸殘基氧化，造成蛋白質(zhì)去折疊和疏水基團(tuán)外露，暴露的疏水基團(tuán)通過疏水相互作用形成聚集體，致使蛋白質(zhì)的表面疏水性下降。

2.5 過氧自由基氧化對米糠蛋白電泳圖譜的影響

張敏等[32]采用Osbron法分級提取米糠蛋白，并通過凝膠電泳測定其分子質(zhì)量，結(jié)果為清蛋白（52.85、76.51、95.43 ku）、球蛋白（76.51、103.12 ku）、谷蛋白（14、20、36.29 ku）和醇溶蛋白（14 ku）。如圖4所示，米糠蛋白亞基分子質(zhì)量與張敏等[32]分析的結(jié)果略有差異，較明顯的條帶有14～16、25、36～38、49、70 ku和100 ku左右。隨著AAPH濃度的增加，電泳圖各泳道之間沒有出現(xiàn)條帶增減現(xiàn)象，且各條帶顏色深淺也沒有顯著變化，表明過氧自由基氧化沒有導(dǎo)致米糠蛋白亞基結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。吳偉等[8]在研究新鮮米糠貯藏0、1、3、5、10 d后制備米糠蛋白的電泳圖時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著新鮮米糠貯藏時(shí)間的延長，米糠蛋白逐漸氧化形成聚集體，并且二硫鍵和非二硫共價(jià)鍵共同參與氧化聚集體的形成，這可能是由于新鮮米糠貯藏過程形成的活性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物具有較強(qiáng)共價(jià)修飾米糠蛋白的能力。

圖4 不同濃度AAPH形成的過氧自由基氧化米糠蛋白電泳圖Fig. 4 Electrophoresis of rice bran protein oxidatively modified by different concentrations of AAPH-derived peroxyl radicals

2.6 過氧自由基氧化對米糠蛋白分子質(zhì)量分布和粒徑分布的影響

圖5 不同濃度AAPH形成的過氧自由基氧化米糠蛋白分子質(zhì)量分布Fig. 5 Molecular mass distribution of rice bran protein oxidatively modified by different concentrations of AAPH-derived peroxyl radicals

表3 過氧自由基氧化對米糠蛋白分子質(zhì)量分布的影響Table 3 Effect of oxidative modification by peroxyl radicals on the molecular mass distribution of rice bran protein

如圖5、表3所示，未氧化米糠蛋白（AAPH濃度為0 mmol/L）分子質(zhì)量分布圖中有2 個(gè)吸收峰，對應(yīng)的保留時(shí)間分別為10.71 min和11.42 min。吳偉等[33-34]提取的米糠球蛋白和谷蛋白在相同的高效液相色譜條件下保留時(shí)間分別為10.81 min和11.35 min，并且由于分子質(zhì)量分布圖中每個(gè)吸收峰起止對應(yīng)的保留時(shí)間跨度較大，因此推測保留時(shí)間10.71 min吸收峰可能是分子質(zhì)量較大的米糠球蛋白、清蛋白以及米糠蛋白聚集體，保留時(shí)間11.42 min吸收峰可能是分子質(zhì)量較小的米糠谷蛋白和醇溶蛋白。隨著AAPH濃度的增加，米糠蛋白分子質(zhì)量分布圖中保留時(shí)間10.71 min峰面積百分比逐漸增加，保留時(shí)間11.42 min峰面積百分比逐漸下降，并且在保留時(shí)間為16.09 min新增一個(gè)吸收峰，對應(yīng)分子質(zhì)量較大的肽類物質(zhì)，表明過氧自由基氧化一方面使得米糠蛋白聚集，另一方面可切斷蛋白質(zhì)主肽鏈，形成分子質(zhì)量較小的肽類物質(zhì)，這與Wu Wei等[12]研究過氧自由基氧化對大豆蛋白分子質(zhì)量分布影響相同。吳偉等[8]在研究新鮮米糠貯藏0、1、3、5、10 d后制備米糠蛋白的分子質(zhì)量分布圖時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著新鮮米糠貯藏時(shí)間的延長，米糠蛋白在保留時(shí)間5.70 min出峰面積百分比顯著增加，保留時(shí)間5.70 min吸收峰對應(yīng)分子質(zhì)量在1 000 ku左右的高分子質(zhì)量聚集體。這可能是由于新鮮米糠貯藏過程中除形成脂質(zhì)自由基，還形成了丙二醛等其他活性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，相比于活性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，代表脂質(zhì)自由基的過氧自由基聚集米糠蛋白能力較差。吳偉[35]在系統(tǒng)研究脂質(zhì)氧化產(chǎn)物對大豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，相比于脂質(zhì)氫過氧化物和活性醛，脂質(zhì)自由基氧化使得大豆蛋白形成可溶聚集體的能力最低。

圖6 不同濃度AAPH形成的過氧自由基氧化對米糠蛋白粒徑分布的影響Fig. 6 Effect of oxidative modification by peroxyl radicals derived from different concentrations of AAPH on the particle size distribution of rice bran protein

如圖6所示，隨著AAPH濃度的增加，氧化米糠蛋白粒徑分布曲線逐漸向大尺寸方向偏移，平均粒徑從127.9 nm增加到179.9 nm，表明濃度逐漸增大的AAPH形成的過氧自由基導(dǎo)致米糠蛋白逐漸形成可溶聚集體。Ye Lin等[13]研究不同濃度AAPH氧化條件下花生蛋白的粒徑分布時(shí)，也認(rèn)為是花生蛋白氧化形成的可溶性聚集體導(dǎo)致粒徑增加。

2.7 過氧自由基氧化修飾對米糠蛋白功能性質(zhì)的影響

表4 不同濃度AAPH形成的過氧自由基對米糠蛋白功能性質(zhì)的影響Table 4 Effect of oxidative modification by peroxyl radicals derived from different concentrations of AAPH on functional properties of rice bran protein

如表4所示，隨著AAPH濃度的增加，氧化米糠蛋白的溶解性逐漸下降，氧化米糠蛋白持水性、持油性、起泡能力、泡沫穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性都是先增加后下降，均在AAPH濃度為3 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值。蔡勇建等[9]在研究新鮮米糠貯藏0、1、3、5、10 d后制備米糠蛋白的功能性質(zhì)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著新鮮米糠貯藏時(shí)間的延長，米糠蛋白溶解性逐漸下降，米糠蛋白持水性、持油性、起泡能力、泡沫穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性先增加后下降。由此可見，過氧自由基氧化米糠蛋白功能性質(zhì)變化趨勢與新鮮米糠貯藏導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化時(shí)的米糠蛋白功能性質(zhì)變化趨勢一致。

當(dāng)AAPH濃度較低時(shí)（≤3 mmol/L），米糠蛋白氧化程度較低，米糠蛋白空間結(jié)構(gòu)略微展開，蛋白質(zhì)分子柔性增加，此時(shí)米糠蛋白溶解性變化幅度較小，較多的水分子有機(jī)會進(jìn)入米糠蛋白內(nèi)部，從而增加持水性；米糠蛋白暴露出來的部分疏水基團(tuán)可與脂質(zhì)結(jié)合，增加其持油性；持水性和持油性的改善使得略微展開的米糠蛋白分子易于吸附到氣-液界面，形成黏彈性能好和穩(wěn)定性強(qiáng)的界面蛋白膜，從而提高米糠蛋白的起泡性質(zhì)和乳化性質(zhì)[9]。當(dāng)AAPH濃度較高時(shí)（＞3 mmol/L），米糠蛋白氧化程度較高，米糠蛋白結(jié)構(gòu)展開程度加大，暴露出較多的疏水基團(tuán)，暴露出的疏水基團(tuán)通過疏水相互作用形成不可溶聚集體，增加米糠蛋白分子的剛性，降低米糠蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使得米糠蛋白溶解性、持水性和持油性顯著下降，并使得米糠蛋白界面穩(wěn)定性下降，從而降低米糠蛋白的起泡性質(zhì)和乳化性質(zhì)[9,19]。

3 結(jié) 論

以米糠蛋白為原料，采用不同濃度AAPH有氧熱分解產(chǎn)生的過氧自由基氧化米糠蛋白，研究過氧自由基氧化對米糠蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響。結(jié)果表明：隨著AAPH濃度的增加，米糠蛋白羰基、二硫鍵、二酪氨酸含量逐漸增加，游離巰基含量逐漸減少，表明過氧自由基導(dǎo)致米糠蛋白發(fā)生了一定程度的氧化。隨著AAPH濃度的增加，米糠蛋白二級結(jié)構(gòu)組成發(fā)生較大變化，α-螺旋、無規(guī)卷曲相對含量下降，β-折疊相對含量增加，氨基酸側(cè)鏈總量呈現(xiàn)先增加后略微下降的趨勢。米糠蛋白的表面疏水性下降、內(nèi)源熒光峰值下降且發(fā)生藍(lán)移，這表明米糠蛋白色氨酸殘基被氧化修飾形成聚集體。過氧自由基氧化對蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)影響較小，但可使得米糠蛋白聚集，也可造成米糠蛋白主肽鏈部分?jǐn)嗔研纬啥嚯?，但過氧自由基氧化以形成米糠蛋白聚集體為主導(dǎo)。過氧自由基氧化引發(fā)米糠蛋白結(jié)構(gòu)變化的同時(shí)，也導(dǎo)致其功能性質(zhì)發(fā)生變化，隨著AAPH濃度的增加，米糠蛋白溶解性逐漸降低，持水性、持油性、起泡能力、泡沫穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)AAPH濃度為3 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值。