熊蘇玥，米瑞芳，陳 曦*，戚 彪，李金春，李家鵬*，喬曉玲，王守偉

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學(xué)研究院，國家肉類加工工程技術(shù)研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068）

食源性致病菌引發(fā)的食品安全事件一直是公共衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)[1-2]。由金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和大腸桿菌O157:H7等細(xì)菌性食物中毒引起的疾病在我國約占食品安全事件的30%～90%，也是世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題[3-4]。曲霉和青霉是食物成品貯藏過程中出現(xiàn)的主要致腐菌[5-7]，其次級代謝產(chǎn)物通常是容易引起疾病的致癌、致畸、致突變的霉菌毒素。因此，加強(qiáng)食品中致病微生物檢測技術(shù)的研究對預(yù)防和控制食源性疾病具有重要意義。

傳統(tǒng)檢測方法時間長，工作量大，準(zhǔn)確度較低[8]。近年來，隨著針對食源性致病菌的分子生物學(xué)檢測手段快速發(fā)展與應(yīng)用，多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測技術(shù)取得很大進(jìn)展。在食源性致病細(xì)菌檢測方面，Wei Caijiao等[9]利用多重PCR同時檢測牛乳中的大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，檢測方法的靈敏度為103CFU/mL，與食品樣品中的單重PCR靈敏度結(jié)果相同。Nguyen等[10]通過12 h的增菌培養(yǎng)可將雞肉等食品中PCR檢測沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出限由增菌前的102CFU/mL降低至101CFU/mL。閆琳等[11]將人工染菌的禽肉食品樣本在增菌12 h后，利用PCR檢測沙門氏菌的檢出限可低至100CFU/25 g。增菌-PCR檢測方法可顯著提高致病菌的檢出限，然而由于不同微生物生長特性存在差異，需要研究開發(fā)通用型培養(yǎng)基應(yīng)用于多種致病菌的同時增菌培養(yǎng)，并抑制其他非靶標(biāo)菌的生長，而且增菌-PCR方法無法定量致病菌的初始數(shù)量；另外，增菌培養(yǎng)時殘留的食品基質(zhì)成分，也有可能影響菌體生長速率和后續(xù)PCR擴(kuò)增，因此該檢測方法還有待進(jìn)一步完善[12]。在食源性霉菌檢測方面，顧雙等[13]利用ITS和pksCT基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測發(fā)酵食品中的霉菌，敖特根巴雅爾等[14]所建立的PCR體系對檢測干肉制品中霉菌的靈敏度為2 ng/μL。目前，細(xì)菌和霉菌的多重PCR檢測在醫(yī)學(xué)中已有報道[15]，但尚鮮見利用多重PCR法同時檢測食品中致病細(xì)菌和霉菌的報道。

因此，本研究針對食品中的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌及常見霉菌，建立一種快速、穩(wěn)定且特異性良好的多重PCR體系，對快速、準(zhǔn)確同時檢測肉制品、豆制品和面制品中5 種致病微生物污染情況進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

香腸、豆腐、面包 北京市購；所用菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）和丹麥科漢森公司，詳見表1。

表1 菌種來源及用于引物設(shè)計的靶標(biāo)基因Table 1 Strains tested in this study and their target genes used for primer design

引物由Invitrogen公司合成；2×TaqPCR MasterMix（含染料）、RNase-free水、細(xì)菌DNA提取試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；DNeasy Plant Mini Kit試劑盒（69104） 德國QIAGEN公司；DL 2000（plus 100）、DL 500 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；DuRed染料北京全品速生物科技有限公司；腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（NB）、李斯特氏菌增菌肉湯（LEB）、營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf 5417R冷凍離心機(jī) 艾本德中國有限公司；Synergy H4多功能酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；T100梯度PCR儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；電泳儀 六一（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體培養(yǎng)

取活化的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7分別于NB培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)3、5 h和2 h，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌于BHI培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)6 h，取處于對數(shù)生長期的新鮮菌液用于細(xì)菌基因組DNA提取。黃曲霉、島青霉和構(gòu)巢曲霉于利用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，黃曲霉培養(yǎng)條件為29 ℃，其他霉菌為25 ℃。黃曲霉、島青霉和構(gòu)巢曲霉取培養(yǎng)基上的新鮮菌落，納地青霉則直接利用凍干菌粉進(jìn)行霉菌基因組DNA提取。

1.3.2 DNA提取

細(xì)菌取新鮮菌液后，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。霉菌經(jīng)玻璃珠振蕩破壁后，利用DNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取霉菌DNA。

1.3.3 引物設(shè)計

選取文獻(xiàn)[16-18]中報道的4 種細(xì)菌的菌種特異性基因，包括金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因（nuc）、沙門氏菌的侵襲基因正調(diào)節(jié)蛋白基因（hilA）、大腸桿菌O157:H7鞭毛基因（flic）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的毒力調(diào)控蛋白基因（prfA），作為靶標(biāo)基因設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于需要同時檢測到不同種屬的霉菌，選擇霉菌18S rRNA基因V5區(qū)設(shè)計特異性引物[19]用以擴(kuò)增食品中常見霉菌。利用Premier 5.0對目的基因進(jìn)行引物設(shè)計以及評價[20]，參考引物的特異性檢測擴(kuò)增結(jié)果，選取5 對擴(kuò)增片段大小有一定差異、退火溫度相近且特異性較高的引物，引物序列見表2。

表2 多重PCR引物序列Table 2 Multiplex PCR primer sequences

1.3.4 多重PCR體系的建立

對每組引物的添加量、退火溫度、P C R循環(huán)數(shù)、延伸時間等因素進(jìn)行優(yōu)化。最終確定的最適反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqPCR MasterMix（含染料）12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.25 μL，由單核細(xì)胞增生李斯特氏菌prfA0.23 μL、沙門氏菌hilA0.42 μL、金黃色葡萄球菌nuc0.20 μL、大腸桿菌O157:H7flic0.20 μL、霉菌18S V5 0.20 μL組成，DNA模板1 μL，雙蒸水ddH2O補(bǔ)足至25 μL。采用降落PCR提高擴(kuò)增的特異性、靈敏度和產(chǎn)量[21]，降落PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，初始退火溫度59 ℃，經(jīng)過6 個循環(huán)且每個循環(huán)減0.4～57 ℃，保持退火溫度為57 ℃擴(kuò)增30 個循環(huán)，退火時間均為30 s，72 ℃延伸25 s，共擴(kuò)增36 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并成像。

1.3.5 多重PCR體系特異性檢測

為確定所建立多重PCR方法的特異性，隨機(jī)選擇三類及四類目的菌株DNA進(jìn)行組合作為DNA模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物有無交叉錯配現(xiàn)象。同時對非目標(biāo)菌DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，選擇玫瑰色庫克菌、變異庫克菌和藤黃微球菌等其他共15 種菌株驗(yàn)證菌種特異性。

1.3.6 多重PCR體系靈敏度檢測

將得到的5 種致病菌DNA質(zhì)量濃度調(diào)整到40 ng/μL后進(jìn)行10 倍梯度稀釋，作為擴(kuò)增DNA模板。即進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)的DNA質(zhì)量濃度分別為4×101～4×10－5ng/μL，每個質(zhì)量濃度的DNA各取1 μL按最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 多重PCR檢測人工污染食品

將培養(yǎng)至對數(shù)期的5 種致病菌分別用生理鹽水10 倍梯度稀釋，使?jié)舛葹?00CFU/mL。參照Kumar等[22]的方法，經(jīng)檢測無菌的香腸樣品均質(zhì)后，分別接種5 種菌，接種量均為100CFU/25 g，污染香腸樣品于營養(yǎng)肉湯中在37 ℃培養(yǎng)9、14 h和20 h后，取每種菌的培養(yǎng)液1 mL混合后分別提取細(xì)菌和霉菌DNA，在人工污染肉制品中驗(yàn)證建立的多重PCR方法。在面包和豆腐中同法進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR特異性檢測結(jié)果

采用單一目的菌株DNA擴(kuò)增以檢測多重PCR引物的特異性，擴(kuò)增結(jié)果顯示大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌與納地青霉、島青霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉4 種霉菌在相應(yīng)位置處均出現(xiàn)清晰的單一條帶（圖1），且片段大小與理論值相符，分別為73、143、192、220 bp與280 bp，未發(fā)現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶。泳道5～8中以納地青霉、島青霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉4 種不同種屬的霉菌DNA為模板，均成功擴(kuò)增出單一條帶，泳道9中同時擴(kuò)增出5 種DNA清晰且有明顯區(qū)分度的條帶，證明該引物對食品中常見的5 種細(xì)菌和霉菌有良好的特異性與較高的擴(kuò)增效率。

1.大腸桿菌O157:H7（Ec）；2.金黃色葡萄球菌（Sa）；3.沙門氏菌（Se）；4.單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Lm）；5.納地青霉（Pn）；6. 黃曲霉（Fa）；7.島青霉；8.構(gòu)巢曲霉；9. Fa＋Ec＋Sa＋Se＋Lm；M. Marker DL500。

如圖2所示，以庫克菌、乳桿菌和葡萄球菌等食品中可能出現(xiàn)的其他菌種作為陰性對照，驗(yàn)證擴(kuò)增體系的菌種特異性。1～15泳道中除低于50 bp的引物二聚體無其他條帶出現(xiàn)，說明該P(yáng)CR擴(kuò)增體系菌種特異性良好，可避免擴(kuò)增出發(fā)酵食品生產(chǎn)中常用的植物乳桿菌等乳酸菌，或者非目標(biāo)致病菌如庫克菌、糞腸球菌等從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

圖2 多重PCR體系菌間特異性Fig. 2 Specificity of strains in multiplex PCR

利用已建立的多重PCR體系對目標(biāo)菌株進(jìn)行引物間特異性的檢測，檢測結(jié)果如圖3所示。泳道1～10的擴(kuò)增結(jié)果表明該體系可擴(kuò)增出任意組合的3 種目標(biāo)菌，泳道11～15的擴(kuò)增結(jié)果表明該體系可擴(kuò)增出任意組合的4 種目標(biāo)菌，泳道16顯示該體系可同時擴(kuò)增出5 種目標(biāo)菌，引物間未發(fā)生交叉錯配現(xiàn)象的情況，同時無非特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，陰性對照無擴(kuò)增條帶。結(jié)果表明建立的多重PCR體系具有非常好的菌種特異性。

圖3 多重PCR引物間特異性Fig. 3 Specificity of primers in multiplex PCR

2.2 多重PCR靈敏度檢測結(jié)果

將5 種菌的基因組DNA進(jìn)行10 倍梯度稀釋后，分別取101、100、10－1、10－2、10－3、10－4、10－5ng作為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。如圖4所示，5 種致病菌中霉菌（黃曲霉）的檢出限可達(dá)10－5ng，而當(dāng)模板量低于10－3ng時金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌的目標(biāo)條帶消失，大腸桿菌O157:H7存在微弱的擴(kuò)增條帶，因此同時檢測5 種菌的最低模板量為10－2ng。

圖4 多重PCR分別檢測大腸桿菌O157：H7（A）、金黃色葡萄球菌 （B）、沙門氏菌（C）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（D）、 黃曲霉（E）以及多重PCR同時檢測5 種微生物（F）的靈敏度 Fig. 4 Sensitivity of multiplex PCR for E. coli O157：H7 (A), S. aureus (B), Salmonella enterica subsp. enterica (C), Listeria monocytogenes (D), Aspergillus flavus (E), and multiplex DNA (F)

2.3 人工污染食品的多重PCR靈敏度檢測結(jié)果

為驗(yàn)證建立的多重PCR方法在食品中應(yīng)用的效果，選取香腸、豆腐和面包分別作為常見肉制品、豆制品和面制品的代表。經(jīng)檢測確認(rèn)無4 種致病細(xì)菌和霉菌的香腸、豆腐和面包中，分別接種5 種目標(biāo)菌，其中接種霉菌為納地青霉，初始接種量均為100CFU/25 g食物。

如圖5所示，增菌9 h后，3 種人工污染食物樣品中均可檢出大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌與霉菌。其中香腸人工污染樣品在增菌9 h時，金黃色葡萄球菌與沙門氏菌的擴(kuò)增條帶較豆腐和面包弱；增菌14 h后，3 種食物中均可檢出沙門氏菌，豆腐中已經(jīng)可以檢測出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌；增菌20 h后，3 種食物中均可檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。因此，經(jīng)過20 h增菌培養(yǎng)，5 種致病微生物檢出限均可達(dá)到100CFU/25 g。同時提取未接菌的食物樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示未出現(xiàn)任何條帶，說明所建立的多重PCR體系可適用于常見食品中這5 種致病微生物的快速檢測。

通過觀察食物基質(zhì)加入培養(yǎng)基混勻后的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)3 種食品中豆腐的加入對培養(yǎng)基的影響最小，無溶出物且形態(tài)保持不變，而面包浸于培養(yǎng)基后經(jīng)過振蕩破碎分散使培養(yǎng)基變得渾濁，香腸的加入則會在培養(yǎng)基表面形成明顯的油脂層，對菌體的培養(yǎng)及菌液的收集造成影響，進(jìn)一步影響提取DNA的質(zhì)量，這可能是導(dǎo)致3 種食物基質(zhì)中檢測致病菌靈敏度差異的主要原因。在Lee等[23]進(jìn)行的6 重PCR檢測技術(shù)研究中也得到相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該研究以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙門氏菌等致病菌污染辣子雞、牡蠣和生菜，分別在SEB富集培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)4、8、12 h后，發(fā)現(xiàn)生菜中8 h即可檢出6 種初始含量為100CFU/mL的致病菌，而在牡蠣中檢出同樣初始含量的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌至少需培養(yǎng)12 h，在辣子雞中同樣初始含量的副溶血弧菌與沙門氏菌也需培養(yǎng)12 h才可以檢出，可見食物基質(zhì)的復(fù)雜性對檢測方法的靈敏度會產(chǎn)生一定影響。

圖5 人工污染香腸、面包、豆腐中5 種致病菌多重PCRFig. 5 Multiplex PCR detection of five artificially contaminated pathogens in sausage, bread and tofu

3 討 論

傳統(tǒng)致病菌檢測工作量大、耗時長且操作繁瑣，相比之下，多重PCR作為一種能夠快速、同時檢測多種致病菌的可靠手段，已在實(shí)際檢測中得到廣泛應(yīng)用[24]，隨著PCR技術(shù)的日益發(fā)展與成熟，能夠同時檢測的微生物種類與檢測靈敏度都在不斷提高[25]，在監(jiān)測食品危害、保障食品安全方面具有良好的應(yīng)用前景。本研究建立的多重PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了同時檢測食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7和霉菌，并成功應(yīng)用于豆腐、香腸、面包3 種食品的檢測，經(jīng)增菌培養(yǎng)20 h后，5 種致病微生物的的檢出限均可達(dá)到100CFU/25 g。

在多重PCR檢測食源性致病菌的相關(guān)研究中，Zhang等[26]將建立的多重PCR方法應(yīng)用于油菜葉等多種食物檢測，增菌24 h后對大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌4 種致病細(xì)菌的檢出限可達(dá)到100CFU/mL。胡冰雪等[27]對人工污染的冷卻肉進(jìn)行過夜培養(yǎng)增菌，其熒光假單胞菌、沙門氏菌檢出限可達(dá)101CFU/mL，而單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出限為70 CFU/mL，這與本實(shí)驗(yàn)中檢測單核細(xì)胞增生李斯特氏菌所需增菌時間最長的結(jié)果一致。馮可等[28]對初始染菌量為100CFU/g的鮮切果蔬進(jìn)行增菌培養(yǎng)，而后采用多重PCR檢測，包括單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在內(nèi)的4 種致病菌能檢出的增菌培養(yǎng)時間為9 h，時間較短，這可能是由于其PCR體系中的Taq酶含量為1 U/μL，而本實(shí)驗(yàn)PCR體系中Taq酶含量僅為0.1 U/μL，雖然增加了檢出時間，但降低了試劑成本。由于不同菌株間生長特性具有差異，往往還需對增菌培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化[29]。Kawasaki等[30]利用一種自制的培養(yǎng)基NO.17肉湯對接種量為101CFU/mL單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行培養(yǎng)，在24 h時活菌數(shù)相比于TSB培養(yǎng)基的2.9（lg（CFU/mL））提高為6.7（lg（CFU/mL））。本研究中采用營養(yǎng)肉湯對5 種微生物進(jìn)行增菌，未來還將進(jìn)一步對培養(yǎng)基進(jìn)行選擇優(yōu)化以縮短增菌時間。

目前鮮見利用多重PCR法同時檢測食品中致病細(xì)菌和霉菌的報道，本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了多重PCR同時擴(kuò)增檢測4 種致病細(xì)菌和常見霉菌，該體系可檢測曲霉、青霉等食品中常見的霉菌。之后可進(jìn)一步研究建立食品中細(xì)菌與霉菌DNA的同時提取方法[31-32]，最終實(shí)現(xiàn)食品中細(xì)菌與霉菌從培養(yǎng)到DNA提取、PCR擴(kuò)增的同時檢測。

4 結(jié) 論

本研究根據(jù)不同菌株的特異性基因設(shè)計引物，建立了一種能夠同時檢測大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌4 種致病細(xì)菌及常見霉菌的多重PCR檢測方法在香腸、豆腐和面包中，分別利用營養(yǎng)肉湯增菌9 h后，大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌與霉菌的檢出限可達(dá)到100CFU/25 g；增菌14 h后，沙門氏菌的檢出限可達(dá)到100CFU/25 g；增菌20 h后，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出限可達(dá)到100CFU/25 g。該方法相較于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法縮短了檢測時間，并可同時檢測食物中4 種致病細(xì)菌和常見霉菌，在食品衛(wèi)生監(jiān)督等領(lǐng)域具有較廣闊的應(yīng)用前景。