鹿保鑫，馬 楠，王 霞，李超楠，錢麗麗，張東杰*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

黑龍江省是我國最大的大豆生產(chǎn)區(qū)[1]。大豆，中國古稱菽，又叫青仁烏豆、黃豆等[2]。大豆籽粒中含各類礦質(zhì)元素，并富含約20%的脂肪和40%的蛋白質(zhì)，是兼具經(jīng)濟(jì)和營養(yǎng)價值的優(yōu)質(zhì)高效作物[3-4]。但是近年來以次充好、以假亂真等食品安全問題日益突出，農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)地保護(hù)問題也越來越受到各國科研人員的高度關(guān)注[5-7]。各國研究者對農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源技術(shù)的研究進(jìn)行了大膽嘗試，故已有了階段性的進(jìn)展，對于農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源技術(shù)可行性的研究日趨成熟。如Ariyama等[8]利用電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）測定洋蔥中Na、Mg、Cs等14 種元素的含量，并結(jié)合線性判別分析建立模型，結(jié)果表明日本、中國、美國等國家洋蔥的整體分類正確率均在90%以上。Bontempo等[9]采用ICP-MS測定了西紅柿中礦物元素Li、Be、B等46 種礦物元素的含量，并利用線性判別分析特征成分進(jìn)行了判別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對意大利3 個區(qū)域的西紅柿的交叉驗(yàn)證正確率均在95%以上。Conde等[10]將火焰原子吸收光譜和原子發(fā)射光譜相結(jié)合，對葡萄酒中的K、Na、Rb等11 種元素的含量進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Na、Mg、Fe等8 種元素對西班牙5個不同地區(qū)葡萄酒產(chǎn)地溯源具有指導(dǎo)意義。此外，國外研究者還利用礦物元素指紋圖譜技術(shù)鑒別土豆[11]、食用油[12]、蜂蜜[13]、茶葉[14]、果汁[15]等植物源農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)地溯源，可見該技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源應(yīng)用廣泛。而有機(jī)成分分析技術(shù)在葡萄酒[16]、橄欖油[17]、蜂蜜[18-19]、咖啡豆[20]、綠茶[21]和獼猴桃[22]等植源性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源上也有相應(yīng)的研究。但是研究學(xué)者們也認(rèn)識到篩選溯源指標(biāo)的適用性和穩(wěn)定性受到多方面因素的影響，因此進(jìn)行產(chǎn)地溯源研究應(yīng)對樣本進(jìn)行連續(xù)多年的采集，為構(gòu)建穩(wěn)定和準(zhǔn)確的產(chǎn)地判別模型而打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)將結(jié)合篩選的與產(chǎn)地和土壤直接相關(guān)的營養(yǎng)和礦物元素作為特征指紋信息，以2014—2016年隨機(jī)采集的黑龍江嫩江和北安大豆主產(chǎn)區(qū)168 份樣本作為建模對象，檢驗(yàn)篩選溯源指標(biāo)的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在2014—2016年隨機(jī)采集來自于黑龍江省嫩江和北安大豆主產(chǎn)區(qū)的大豆樣本共168 份。具體采樣情況詳見表1。

濃硝酸（65%）、濃硫酸、氫氟酸、高氯酸、雙氧水（均為優(yōu)級純），鹽酸（分析純） 北京化學(xué)試劑研究所；內(nèi)標(biāo)物（優(yōu)級純） 美國Agilent公司；超純水（電阻率＞18.2 MΩ·cm，20 ℃） 國家雜糧科學(xué)技術(shù)研究中心；單元素國家標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L）、GBW10055生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-大豆 國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采購中心；多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液5183-4688、8500-6944、8500-6948及內(nèi)標(biāo)（Bi、Ge、In） 美國安捷倫公司。

表1 2014—2016年樣本信息Table 1 Information about soybean samples harvested during the year 2014–2016

1.2 儀器與設(shè)備

BLF-YB2000型高速多功能粉碎機(jī) 深圳百利福工貿(mào)有限公司；DGG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；AL104型電子天平 美國梅特勒-托利多公司；iCAP6000系列電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 美國Thermo公司；Mars6型高通量密閉微波消解系統(tǒng) 美國CEM公司；Smart-N-15UV型超純水設(shè)備蘇州江東精密儀器有限公司；新諾DB-3電熱板 鹽城市創(chuàng)仕源電熱設(shè)備有限公司。MARS高通量密閉微波消解儀 美國CEM公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

在大豆成熟期采集黑龍江嫩江和北安地區(qū)的大豆樣品，準(zhǔn)備鐮刀、大豆編織網(wǎng)袋、樣品標(biāo)簽、采樣記錄表等。根據(jù)代表性采樣原則，采用“S”型采樣法，依照不同保護(hù)范圍及種植范圍大小設(shè)置采樣點(diǎn)，每塊地域隨機(jī)設(shè)置9 個重復(fù)點(diǎn)，每個采樣點(diǎn)沿植株底部割取大豆4 m2左右，且每個采樣點(diǎn)大概采取1～2 kg大豆放入編織網(wǎng)袋中，寫好標(biāo)簽、編號掛好，記錄采樣地點(diǎn)、經(jīng)緯度、品種、采樣時間和采樣人等信息。采集大豆對應(yīng)土樣（采集的是根際土壤，是土壤的耕作層，且土壤深度是從表層到20 cm的土樣），編號。

1.3.2 樣本預(yù)處理

選取無破損、無蟲蝕飽滿的大豆樣品100 g作為分析樣品。將大豆樣品先用蒸餾水沖洗干凈再用去離子水沖洗數(shù)次，放入60 ℃的烘箱中鼓風(fēng)干燥8 h，再用BLF-YB2000型高速多功能粉碎機(jī)磨制得大豆全粉，過100 目篩待測[23]。每份土樣自然晾干用土壤粉碎機(jī)粉碎后過100 目篩待測。所有樣本采用統(tǒng)一處理方式。

1.3.3 樣本消解及元素含量測定

參考趙海燕等[24]方法。準(zhǔn)確稱取0.200 0 g左右大豆全粉，置于消化管中，加入6 mL濃硝酸（65%，分析純）和3 mL鹽酸（37%，分析純），放入MARS高通量密閉微波消解儀中，采用程序升溫法進(jìn)行微波消解。消解后得到澄清透明的溶液，溶液經(jīng)排酸后用超純水洗滌樣品，定容到100 mL，采用同樣方法進(jìn)行空白樣品和大豆標(biāo)準(zhǔn)物樣品消解。

參考龍加洪等[25]方法。準(zhǔn)確稱取0.500 0 g左右土樣于微波消解罐中，用少量水潤濕后加入5 mL硝酸、3 mL氫氟酸、1 mL雙氧水，采用程序升溫法進(jìn)行微波消解，消解后得到澄清透明的溶液于電熱板上驅(qū)趕白煙并蒸至呈黏稠狀。取下稍冷后加入1 mL硝酸溶液溶解可溶性殘?jiān)哭D(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中冷卻、定容、搖勻后待測。

用7500a ICP-MS測定大豆及土壤樣品中Na、Mg、Al、K、Ca、Sc、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Y、Mo、Ru、Rh、Rd、Ag、Cd、Sn、Sb、Te、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ir、Pt、Au、Tl、Pb、Th和U共52 種礦物元素的含量。用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，以美國Agilent公司的環(huán)境標(biāo)樣為標(biāo)準(zhǔn)樣品，用內(nèi)標(biāo)元素In、Li、Y、Tb、Bi和Ge保證儀器的穩(wěn)定性。當(dāng)內(nèi)標(biāo)元素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差大于5%時，需要對樣品重新測定，且每個樣品重復(fù)測定3 次。

1.3.4 樣本營養(yǎng)元素含量測定

蛋白質(zhì)含量測定：采用凱氏定氮法GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》[26]；粗脂肪含量測定：采用GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》[27]；灰分含量測定：采用GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》殘余法[28]；可溶性總糖含量測定：采用硫酸-苯酚法[29-30]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、主成分分析、聚類分析和判別分析（逐步判別分析）。比較不同產(chǎn)地大豆中有機(jī)成分和礦物元素的差異顯著性，建立大豆產(chǎn)地判別模型，鑒別大豆產(chǎn)地來源并驗(yàn)證產(chǎn)地判別效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤礦物元素含量對大豆籽粒礦物元素含量的影響

表2 大豆和土壤樣品礦物元素含量的相關(guān)系數(shù)Table 2 Pearson correlation coefficients between mineral elements in soybeans and soil

由表2可知，As、Ru、Gd含量在大豆與土壤間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），Tb含量在大豆與土壤間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明大豆籽粒中元素As、Ru、Gd、Tb含量隨著表層土壤中相應(yīng)元素含量的增加而增加，增加程度大小的順序依次為：Tb＞Ru＞As＞Gd。

2.2 不同產(chǎn)地大豆樣本中礦物元素含量

由表3可知，連續(xù)3 a分析不同產(chǎn)地大豆樣本中礦物元素的含量，經(jīng)過方差分析和主成分分析并結(jié)合2.1節(jié)土壤礦物元素含量對大豆籽粒礦物元素含量的影響元素，得到與產(chǎn)地和土壤直接相關(guān)的23 個特征指標(biāo)，分別為Tb、Ir、Ti、Mg、K、V、Mn、Co、Cu、Rb、Sr、Pd、La、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Er、Hf、As和Ru。

表3 不同產(chǎn)地大豆樣本中礦物元素含量Table 3 Contents of mineral elements in soybean samples from different producing areas

2.3 不同產(chǎn)地大豆樣本中營養(yǎng)成分含量

3 a聯(lián)合起來分析不同產(chǎn)地大豆樣本中營養(yǎng)元素的含量，經(jīng)過方差分析和主成分分析得到與產(chǎn)地直接相關(guān)的3 個指標(biāo)：蛋白質(zhì)、脂肪和可溶性總糖，結(jié)果如表4所示。

表4 不同產(chǎn)地大豆品質(zhì)差異分析Table 4 Differential quality analysis of soybean samples from different producing regions

2.4 不同產(chǎn)地大豆樣品有機(jī)成分輔助礦物元素含量的聚類分析

3 a聯(lián)合起來分析不同產(chǎn)地大豆樣本中礦物元素及有機(jī)成分的含量，采用系統(tǒng)聚類法（聚類方法-Ward聯(lián)接法、度量標(biāo)準(zhǔn)-平方Euclidean距離、轉(zhuǎn)換值-標(biāo)準(zhǔn)化Z得分），對黑龍江嫩江、北安168 份大豆樣品中的23 個礦物元素（Tb、Ir、Ti、Mg、K、V、Mn、Co、Cu、Rb、Sr、Pd、La、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Er、Hf、As、Ru）及3 個有機(jī)成分（蛋白質(zhì)、脂肪、可溶性總糖）含量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖1。

圖1 使用Ward聯(lián)接的樹狀圖Fig. 1 Ward dendrogram

由圖1可知，當(dāng)聚類標(biāo)準(zhǔn)（距離）不同時，聚類結(jié)果不同。從聚類距離為15處切斷樹狀圖時，樣品被分為2 大類：一類為黑龍江北安樣品；另一類為黑龍江嫩江樣品，其中含有11 個黑龍江北安樣品（45、46、47、48、49、50、52、55、92、97、102）歸類錯誤，且黑龍江嫩江有2 個樣品（5、25）在兩大類樣品之外，分別單獨(dú)聚為一類。因此黑龍江北安有近1/6的樣品歸類錯誤，黑龍江嫩江有1/11的樣品歸類錯誤。雖然聚類過程中有個別樣品出現(xiàn)歸類錯誤，但大多數(shù)大豆樣品產(chǎn)地的區(qū)分取得了較好的效果。

2.5 不同產(chǎn)地大豆樣品有機(jī)成分輔助礦物元素含量的判別分析

為驗(yàn)證篩選的產(chǎn)地特征指標(biāo)的溯源效果，將與產(chǎn)地直接相關(guān)的元素Tb、Ir、Ti、Mg、K、V、Mn、Co、Cu、Rb、Sr、Pd、La、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Er、Hf和與土壤直接相關(guān)的元素As、Ru、Gd、Tb，還有大豆中與產(chǎn)地直接相關(guān)的營養(yǎng)元素蛋白質(zhì)、脂肪和可溶性總糖共26 個溯源指標(biāo)結(jié)合在一起建立Fisher判別模型。樣品分成訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，選擇2/3的樣本作為訓(xùn)練集建立模型，選擇1/3的樣本作為驗(yàn)證集，用于驗(yàn)證建立的溯源模型的準(zhǔn)確性，見表5～7、圖2、3。

表5 建立Fisher判別函數(shù)系數(shù)Table 5 Fisher discriminant function coefficients

由表5可得到兩產(chǎn)地的判別模型：

由表6可知，對訓(xùn)練集產(chǎn)地的整體正確判別率為96.4%；交叉驗(yàn)證結(jié)果顯示，兩個產(chǎn)地總體上已有93.8%的樣品被正確識別，其中黑龍江嫩江有98.1%的樣品被正確識別，黑龍江北安有90.0%的樣品被正確識別。

表6 不同產(chǎn)地Fisher判別函數(shù)分類結(jié)果Table 6 Classification of different geographical origins with Fisher discriminant function

表7 驗(yàn)證不同產(chǎn)地Fisher判別函數(shù)分類結(jié)果Table 7 Validation of Fisher discriminant function for classification of different geographical origins

由表7可知，對驗(yàn)證集產(chǎn)地的整體正確判別率為98.2%；交叉驗(yàn)證結(jié)果顯示，兩個產(chǎn)地總體上已有92.9%的樣品被正確識別，其中黑龍江嫩江有96.2%的樣品被正確識別，黑龍江北安有90.0%的樣品被正確識別。

從判別結(jié)果可以看出，引入與產(chǎn)地、土壤相關(guān)的元素和引入與產(chǎn)地相關(guān)的大豆中的營養(yǎng)元素對驗(yàn)證集的產(chǎn)地判別效果好于訓(xùn)練集，原因可能是選擇的驗(yàn)證集樣本距離與組質(zhì)心更接近。由圖2可看出，黑龍江嫩江大豆中的營養(yǎng)與礦物元素的含量更接近其組心質(zhì)，而黑龍江北安地區(qū)的大豆中的營養(yǎng)與礦物元素的含量相對黑龍江嫩江地區(qū)較分散，即黑龍江嫩江地區(qū)大豆的判別效果好于黑龍江北安地區(qū)，說明黑龍江嫩江大豆與黑龍江北安大豆特征指標(biāo)差異較顯著，模型判別效果正確率高。但對于黑龍江嫩江和黑龍江北安產(chǎn)地大豆隨機(jī)采集3 a樣本的交叉判別率仍沒達(dá)到100%正確判別，這主要與兩個產(chǎn)地土壤環(huán)境相近和種植品種相似有關(guān)，故今后要注意對兩大豆主產(chǎn)地的土壤環(huán)境和種植品種方面進(jìn)行詳細(xì)的研究。

圖2 黑龍江嫩江大豆（A）和黑龍江北安大豆（B）的典型判別函數(shù)圖Fig. 2 Typical discriminant function graphs for Nenjiang (A) and Bei’an (B) grown soybeans

3 結(jié) 論

隨機(jī)采集2014—2016年黑龍江嫩江和北安大豆主產(chǎn)區(qū)共168 份樣本，對篩選的與產(chǎn)地和土壤直接相關(guān)的元素以及大豆中與產(chǎn)地直接相關(guān)的特征營養(yǎng)元素進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，采用步進(jìn)式方法篩選出的10 種特征指標(biāo)建立的判別模型對訓(xùn)練集大豆產(chǎn)地的整體正確判別率為96.4%，其中對黑龍江嫩江、北安大豆產(chǎn)地的正確判別率分別為98.1%、95%；該模型的交叉驗(yàn)證結(jié)果顯示，黑龍江嫩江和北安有93.8%的樣品被正確識別，其中黑龍江嫩江有98.1%的樣品被正確識別，黑龍江北安有90.0%的樣品被正確識別?；卮鷻z驗(yàn)對驗(yàn)證集大豆產(chǎn)地的整體正確判別率為98.2%，其中對黑龍江嫩江、北安大豆產(chǎn)地的正確判別率分別為100%、96.7%；該模型的交叉驗(yàn)證結(jié)果顯示，黑龍江嫩江和北安有92.9%的樣品被正確識別，其中黑龍江嫩江有96.2%的樣品被正確識別，黑龍江北安有90.0%的樣品被正確識別。驗(yàn)證集中對黑龍江嫩江、北安大豆產(chǎn)地的正確判別率的判別結(jié)果略高于26 種特征指標(biāo)的判別結(jié)果，說明這7 種礦物元素和3 種有機(jī)成分是用于大豆產(chǎn)地判別的主要特征指標(biāo)，攜帶了充分的產(chǎn)地判別信息。