秦軍建 邢艷芳 莫江彬 劉筱萍 侯鐵奇

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣州510150)

慢性腎衰竭(Chronic renal failure,CFR)是指各種原因造成的慢性、進(jìn)行性腎實(shí)質(zhì)損害，導(dǎo)致腎臟明顯萎縮，難以維持其基本功能，臨床上以代謝產(chǎn)物潴留，水、電解質(zhì)及酸堿失衡，全身系統(tǒng)受累為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，其嚴(yán)重影響我國(guó)居民的健康及生活[1]。目前，臨床上對(duì)于CFR治療以透析、腎臟移植治療為主，通過(guò)透析能替代部分腎臟功能，但是難以替代腎臟的內(nèi)分泌、代謝功能等，導(dǎo)致臨床死亡率較高。腎臟移植由于供體數(shù)量相對(duì)有限，移植后醫(yī)療費(fèi)用、移植后并發(fā)癥發(fā)生率較高，難以在基層醫(yī)院推廣實(shí)施[2]。隨著干細(xì)胞移植理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，為慢性腎衰竭的治療提供了新的方法。文獻(xiàn)報(bào)道顯示：干細(xì)胞在特定的條件下除了能分化為骨、軟骨、脂肪細(xì)胞外，還能向腎臟細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等分化，并且干細(xì)胞來(lái)源相對(duì)較廣[3]。因此，利用干細(xì)胞技術(shù)尋找有效的方法促進(jìn)腎臟損傷修復(fù)、重塑能為腎臟病的治療開(kāi)辟新的方向。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSC)是一類特殊的細(xì)胞，由于細(xì)胞分離、制備方法簡(jiǎn)單并且植入機(jī)體后免疫原性較低而在組織工程中廣泛使用[4]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示：MSC細(xì)胞可塑性相對(duì)較強(qiáng)，能在特定的條件下向多種細(xì)胞分化，而用于腎臟疾病中則能促進(jìn)缺損部位修復(fù)、再生[5]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究表明[6]：移植外源性MSC用于腎臟疾病中有助于改變腎臟局部微循環(huán)，促進(jìn)血管生成，降低炎癥反應(yīng)發(fā)生。但是部分學(xué)者認(rèn)為干細(xì)胞移植后主要通過(guò)旁分泌減輕腎臟損傷[7]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示：MSC移植后能促進(jìn)腎臟缺損部位修復(fù)，改善局部微循環(huán)，防止損傷細(xì)胞凋亡[8]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的微泡(Micro-vesicles,MVs)是從細(xì)胞表面脫落或細(xì)胞區(qū)室釋放的小圓形膜片，但是微泡的生物學(xué)意義并未得到重視[9]。研究表明[10]：微泡能通過(guò)多種不同的方式影響靶細(xì)胞的行為，將其用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)慢性腎衰竭中有助于促進(jìn)腎功能恢復(fù)，但是不同學(xué)者試驗(yàn)結(jié)果存在爭(zhēng)議。本研究以2015年5月～2016年3月醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)的SD大鼠42只作為研究對(duì)象，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其來(lái)源的微泡制備方法及在慢性腎衰竭中的修復(fù)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1對(duì)象 選擇2015年5月～2016年3月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)的SD大鼠(8周齡)42只作為研究對(duì)象，雄雌隨機(jī)，體質(zhì)量186～215 g，平均(200.08±10.63)g，所選動(dòng)物均由廣州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(新)2011-0004。SD大鼠飼養(yǎng)時(shí)控制實(shí)驗(yàn)室恒溫(20±2)℃，恒濕(50～60)%，SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食，試驗(yàn)均通過(guò)醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)同意。2只大鼠用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備，40只大鼠用于慢性腎衰竭模型制備。隨機(jī)取10只大鼠設(shè)為空白對(duì)照組；30只大鼠建模后隨機(jī)數(shù)字法分為陽(yáng)性對(duì)照組(n=10)、干細(xì)胞組(n=10)及微泡干預(yù)組(n=10)。

1.1.2主要儀器和試劑 冰凍切片機(jī)、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液、RIPA Lysis Buffer 蛋白裂解液、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、倒置相差顯微鏡成像系統(tǒng)、手術(shù)器械一套、脂質(zhì)超聲微泡造影劑等相關(guān)試劑和儀器廠家見(jiàn)表1。

1.2方法

1.2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備和鑒定 ①細(xì)胞的分離、培養(yǎng)。利用密度梯度離心法完成單一核細(xì)胞分離，采用貼壁方法完成細(xì)胞的培養(yǎng)。取2只健康的SD大鼠，采用濃度4%戊巴比妥鈉麻醉后脫毛，將大鼠固定在操作臺(tái)上，在無(wú)菌條件下將雙下肢脛骨、股骨取出，剔除肌肉及結(jié)締組織，浸泡在PBS中，剪掉大鼠股骨與脛骨兩端，采用含10 kU/L的肝素鹽水連續(xù)沖洗，收集沖洗液。向沖洗液中加入4 ml分離液并一同移到10 ml離心管中，2 000 r/min離心20 min，獲得4層離心液，取第二層離心液，懸浮，2 000 r/min離心5 min，去除上層清液，放入完全培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，取懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，每3 d換液一次，待細(xì)胞融合80.0%～90.0%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)[11]。②MSC細(xì)胞鑒定。采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面特異性抗原。取第三代生長(zhǎng)的細(xì)胞，PBS 2次沖洗，采用消化液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行1～2 min消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待50.0%圓形細(xì)胞時(shí)加入終止液，采集細(xì)胞1 000 r/min離心5 min，重懸在EP管中，向上述分離制備細(xì)胞中加入CD29一抗，孵育30 min，熒光標(biāo)記后加入二抗，孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀完成CD29檢測(cè)，設(shè)置對(duì)照組細(xì)胞，完成細(xì)胞的鑒定[12]。

表1主要儀器和試劑

Tab.1Maininstrumentsandreagents

Major instruments and reagentsManufacturer/LotFrozen slicerLeica CM1900DMEM/F12 cell culture fluidUnited States GibcoRIPA Lysis Buffer Protein LysateChina BiyuntianInverted phase contrast microscopeGermanyCell counting plateShanghai refinement of biochemical rea-gents Co,Ltd.Flow cytometerBecton Dickinson,USASurgical instrumentsHospital supplyLipid ultrasound microbubblecontrast agentPrepared according to the Institute of Radiology using conventional methodsOptima L-90K UltracentrifugeBeckman Coulter

1.2.2慢性腎衰竭模型制備及處理方法 ①動(dòng)物模型建立。取40只健康SD大鼠，取10只大鼠設(shè)為空白對(duì)照組；30只大鼠采用腎切除5/6合并高鹽飲食3個(gè)月方法建立大鼠慢性腎衰竭模型。手術(shù)器械經(jīng)過(guò)高壓消毒、滅菌，對(duì)每只大鼠采用2%異氟醚、氧氣吸入方法麻醉，待麻醉生效后進(jìn)行常規(guī)消毒、鋪巾，從腹部中線縱行切開(kāi)皮膚，確定腹主動(dòng)脈的位置，從腹主動(dòng)脈去除血，利用兩步法完成5/6腎臟切除手術(shù)完成大鼠慢性腎衰竭動(dòng)物模型，2/3左腎采用帶有電極止血鉗進(jìn)行融化；第二次術(shù)后1周結(jié)扎并切斷右側(cè)腎臟血管、周?chē)M織，將右側(cè)腎臟摘除。SD大鼠建模后采用高鹽連續(xù)喂養(yǎng)3個(gè)月。②慢性腎衰竭大鼠處理。 陽(yáng)性對(duì)照組建模成功后不采取任何措施處理，干細(xì)胞組進(jìn)行移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療，經(jīng)尾靜脈注射1 ml骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(細(xì)胞密度為2.0×106個(gè)/ml)；微泡干預(yù)組移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后以強(qiáng)度為1.0 W/cm2及頻率為1 MHz 超聲微泡輻照。將建模后大鼠經(jīng)尾靜脈注射0.5 ml造影劑，密度為2.0×106個(gè)/ml，輻照參數(shù)：強(qiáng)度為1.0 W/cm2及頻率為1 MHz超聲微泡輻照，輻照5 s，停5 s，連續(xù)進(jìn)行1 min[13]。

1.2.3觀察指標(biāo) ①細(xì)胞形態(tài)觀察。取分離、培養(yǎng)獲得的細(xì)胞，分別在培養(yǎng)第1天、第3天及傳代后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)方式[14]。②細(xì)胞表面特異性抗原測(cè)定。采用流式細(xì)胞儀對(duì)制備培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞表面特異性抗原CD29進(jìn)行測(cè)定[15]。③肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)蛋白表達(dá)。4組大鼠修復(fù)7 d后每組處死大鼠5只，取出腎組織，提取腎組織總蛋白，采用Western blot測(cè)定HGF、EGF蛋白表達(dá)條帶吸光度值[16]。④炎性反應(yīng)及細(xì)胞黏附分子1。4組大鼠處理前、后經(jīng)尾靜脈取血 3 ml，完成血清分離后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定各組腫瘤壞死因子α(TNF-α)及細(xì)胞黏附分子1水平，有關(guān)操作嚴(yán)格遵循儀器操作說(shuō)明書(shū)完成[17]。⑤HE染色。4組大鼠均連續(xù)進(jìn)行30 d干預(yù)，修復(fù)完畢后每組處死大鼠5只，取腎臟組織，制備5 μm切片，行HE染色[18]。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)大鼠數(shù)量 本研究中納入42只SD大鼠，大鼠全部納入試驗(yàn)結(jié)果，中途未發(fā)生死亡、脫落。

2.2制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 剛接種的MSC細(xì)胞1 d后培養(yǎng)瓶底可見(jiàn)多種形態(tài)細(xì)胞，為了進(jìn)一步純化細(xì)胞，3 d 換液一次，細(xì)胞純化呈梭狀、紡錘狀，以旋渦方式生長(zhǎng)；細(xì)胞貼壁后生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞傳代一次需要3 d，經(jīng)過(guò)3代培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較多，見(jiàn)圖1。

2.3制備培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面特異性抗原測(cè)定 流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果表明：對(duì)照組細(xì)胞表面CD29幾乎不表達(dá)，而MSC細(xì)胞表面CD29陽(yáng)性率為91.54%，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面特征，見(jiàn)圖2。

2.4Western blot完成4組大鼠HGF、EGF蛋白測(cè)定 Western blot結(jié)果表明：HGF蛋白在4組相對(duì)分子量為82 000部位存在特異性條帶；而EGF蛋白則在4組相對(duì)分子量為5 500部位存在特異性條帶，且微泡干預(yù)組特異性條帶較粗，其次為干細(xì)胞組，見(jiàn)圖3。

2.54組SD大鼠炎性反應(yīng)及細(xì)胞黏附分子1水平比較 微泡干預(yù)組與空白對(duì)照組TNF-α及細(xì)胞黏附分子1水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；微泡干預(yù)組TNF-α水平，低于干細(xì)胞組與陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)；微泡干預(yù)組細(xì)胞黏附分子1水平高于干細(xì)胞組與陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)；干細(xì)胞組TNF-α水平低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)；干細(xì)胞組細(xì)胞黏附分子1水平高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 制備細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)形態(tài)Fig.1 Preparation of cells at different time points morphologyNote: A.The 1 d morphology of cell culture;B.The 3 d morphology of cell culture;C.The morphology of cells after subculture.

圖2 制備細(xì)胞表面特異性抗原測(cè)定Fig.2 Preparation of cell surface specific antigen assayNote: A.The expression of CD29 in the control group;B.The expression of CD29 in the MSC.

2.64組大鼠修復(fù)30 d后HE染色結(jié)果比較 陽(yáng)性對(duì)照組建模后未經(jīng)任何處理，腎臟損傷明顯，存在大量炎性細(xì)胞；空白對(duì)照組未參與建模，腎臟組織完整，未見(jiàn)腎臟組織損傷；干細(xì)胞組修復(fù)30 d后腎臟損傷緩解，仍存在少許炎性細(xì)胞；微泡干預(yù)組修復(fù)后30 d腎臟組織損傷明顯改善，未見(jiàn)炎性細(xì)胞，見(jiàn)圖4。

圖3 Western blot完成4組大鼠HGF、EGF蛋白測(cè)定Fig.3 Four groups of rats HGF,EGF protein determination by Western blot

圖4 4組大鼠修復(fù)30 d后HE染色結(jié)果比較(×200)Fig.4 Comparison of HE staining results in four groups after 30 days of repair(× 200)Note: A.The positive control group HE staining;B.The blank control group HE staining;C.The stem cell group HE staining;D.The microbubble intervention group HE staining.

GroupsnTNF-α(mg/ml)Before processingAfter processingCell adhesion moleculeBefore processingAfter processingMicrobubble intervention group104.82±0.981.12±0.541)2)3)8.19±1.213.82±0.651)2)3)Stem cell group104.83±0.992.32±0.741)3)8.20±1.255.49±0.941)3)Positive control group104.95±0.993.85±0.793)8.21±1.277.83±0.993)Blank control group101.03±0.231.05±0.243.17±1.183.16±0.63

Note：1)P<0.05 compared with positive control group;2)P<0.05 compared with stem cell group;3)P<0.05 compared with blank control group.

3 討論

干細(xì)胞是一類相對(duì)復(fù)雜的細(xì)胞群，在特定的條件下能實(shí)現(xiàn)多向分化、自我更新。目前，臨床上研究相對(duì)較多的是源于骨髓中的成體干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞[19]。國(guó)外學(xué)者研究表明[20]：將間充質(zhì)干細(xì)胞用于心肌梗死、腦梗死、肝功能衰竭中能取得理想的效果，間充質(zhì)干細(xì)胞能分泌促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，從而為MSC細(xì)胞移植營(yíng)造良好的微環(huán)境。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，MSC細(xì)胞在腎臟疾病治療中也取得理想的效果[21]。本課題中，采用密度梯度離心法完成單一核細(xì)胞分離，采用貼壁方法完成細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定。本研究中，細(xì)胞換液一次細(xì)胞純化呈梭狀、紡錘狀，以旋渦方式生長(zhǎng)；細(xì)胞貼壁后生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞傳代一次需要3 d，經(jīng)過(guò)3代培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較多；流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果表明：對(duì)照組細(xì)胞表面CD29幾乎不表達(dá)，而MSC細(xì)胞表面CD29陽(yáng)性率為91.54%，制備細(xì)胞CD29呈陽(yáng)性。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)慢性腎臟損傷機(jī)制可能為：干細(xì)胞能為腎臟部位細(xì)胞提供更多的生長(zhǎng)環(huán)境，細(xì)胞通過(guò)局部調(diào)節(jié)受損免疫及炎癥反應(yīng)有助于促進(jìn)血管的生成及重建，能在特定的條件下分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，有助于促進(jìn)自身的修復(fù)，抑制腎小管上皮細(xì)胞的分化，有助于減少膠原的形成[22，23]。但是，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移植修復(fù)慢性腎臟損傷時(shí)受到的影響因素較多，包括體外增殖及定向遷移潛能、移植過(guò)程中細(xì)胞密度過(guò)高、過(guò)度傳代等，均會(huì)造成干細(xì)胞提前衰老，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)多邊形態(tài)、影響修復(fù)效果[24]。

干細(xì)胞植入的有效性及靶向性是干細(xì)胞移植治療慢性腎衰竭的關(guān)鍵，且最近超聲介導(dǎo)微泡的生物學(xué)效應(yīng)被廣泛關(guān)注及研究。微泡能引起空化效應(yīng)導(dǎo)致一些微觀的生物學(xué)反應(yīng)，能引起局部炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子等[25]。經(jīng)過(guò)微泡處理后能增加骨骼肌毛細(xì)血管細(xì)胞黏附分子1及血小板源生長(zhǎng)因子表達(dá)水平，從而促進(jìn)骨缺損修復(fù)能力。本研究中，微泡干預(yù)組TNF-α水平低于干細(xì)胞組與陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)；微泡干預(yù)組細(xì)胞黏附分子1水平高于干細(xì)胞組與陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)；干細(xì)胞組TNF-α水平低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)；干細(xì)胞組細(xì)胞黏附分子1水平高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。提示：微泡能提高慢性腎衰竭組織細(xì)胞黏附分子1表達(dá)水平，有助于抑制炎癥因子水平。國(guó)外學(xué)者采用超聲介導(dǎo)微泡后產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)用于非缺血性心肌病中均取得理想效果，其機(jī)制均與超聲介導(dǎo)微泡產(chǎn)生局部生物學(xué)效應(yīng)，使細(xì)胞黏附分子表達(dá)增加，可能通過(guò)調(diào)節(jié)心肌組織膠原的合成和降解，改善心肌局部膠原的含量，同時(shí)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢從而實(shí)現(xiàn)修復(fù)缺損部位的目的[26]。HGF蛋白及EGF蛋白均能加速腎損傷后的修復(fù)。通常而言，EGF存在腎臟細(xì)胞表面受體酪氨酸激酶激活細(xì)胞信號(hào)，從而使微泡介導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能縮短腎損傷的修復(fù)[27]。同時(shí)，腎臟祖細(xì)胞及上皮細(xì)胞對(duì)于EGF均能發(fā)生明顯的增生反應(yīng)，而HGF則對(duì)于腎臟衍生細(xì)胞、腎臟固有細(xì)胞能發(fā)揮良好的有絲分裂、變形、運(yùn)動(dòng)及分化能力[28，29]。本研究中，Western blot結(jié)果表明：HGF蛋白在4組相對(duì)分子量為 82 000 部位存在特異性條帶；而EGF蛋白則在4組相對(duì)分子量為5 500 部位存在特異性條帶，且微泡干預(yù)組特異性條帶較粗，其次為干細(xì)胞組。此外，本課題從組織學(xué)角度對(duì)超聲輔助微泡后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)慢性腎衰竭效果進(jìn)行分析，結(jié)果表明：陽(yáng)性對(duì)照組建模后未經(jīng)任何處理，腎臟損傷明顯，存在大量炎性細(xì)胞；空白對(duì)照組未參與建模，腎臟組織完整，未見(jiàn)腎臟組織損傷；干細(xì)胞組修復(fù)30 d后腎臟損傷緩解，仍存在少許炎性細(xì)胞；微泡干預(yù)組修復(fù)后30 d腎臟組織改善未見(jiàn)炎性細(xì)胞。由此看出：干細(xì)胞及微泡處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均能促進(jìn)慢性腎臟損傷修復(fù)，但是微泡處理后修復(fù)效果更加，能為慢性腎臟損傷修復(fù)提供新的思路[30]。

綜上所述，采用全骨髓法能分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將頻率為1 MHz、強(qiáng)度1.0 W/cm2脈沖超聲輻照微泡用于慢性腎衰竭大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)中有助于抑制炎性反應(yīng)，提高細(xì)胞黏附分子1水平，具有廣泛的應(yīng)用前景。