鐘丹丹 馬紅慧 劉加順

(濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院，濰坊262500)

哮喘是一種慢性炎癥性呼吸道疾病,其發(fā)病率有逐年升高趨勢[1]。遺傳及環(huán)境等因素密切影響哮喘的病理過程,但作用機(jī)制尚未闡明[2]。細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在包括哮喘在內(nèi)的各種免疫性疾病中起主導(dǎo)作用，尋找新的細(xì)胞因子和其他治療哮喘方法是最近研究的熱點(diǎn)。IL-18是IL-1家族成員[3]，在細(xì)胞免疫微調(diào)過程中發(fā)揮著重要作用[4]，也可作為Th2細(xì)胞發(fā)育和IgE產(chǎn)生的輔因子，并在Th1細(xì)胞的分化中起重要作用[5]。Wild等[6]研究發(fā)現(xiàn)IL-18的表達(dá)水平與哮喘的發(fā)病有關(guān)，哮喘患者血清中IL-18水平較健康人顯著升高，并報(bào)道了哮喘易感性的IL-18的多態(tài)性，表明IL-18可能與哮喘治療有關(guān)。Rovina等[7]通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-18蛋白水平在肺炎加重期間升高，小鼠通過IL-18激活Th2細(xì)胞因子和氣道嗜酸粒細(xì)胞增多而產(chǎn)生變應(yīng)性哮喘。此外，李鑫等[8]在嚴(yán)重的哮喘患者痰液上清中也檢測到IL-18。

諸多基因與哮喘易感性相關(guān)已經(jīng)被國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)，但因人體、地理位置、種族、生活環(huán)境等都存在差異，哮喘與IL-18的相關(guān)性研究報(bào)道在國內(nèi)比較罕見。本文探究了IL-18-137G/C、-607C/A基因的多態(tài)性與哮喘患者的易感性是否相關(guān)，從遺傳學(xué)角度進(jìn)一步揭示哮喘的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 參照《全球哮喘防治指南》納入自2016年3月到2017年9月我院就診哮喘患者301例為研究對象(哮喘組)，年齡為18～77歲，平均年齡(48.60±7.80)歲[9]；選擇同期于醫(yī)院健康體檢288例志愿者為對照組(健康組)。健康組年齡為18～79歲，平均年齡(49.30±7.80)歲;其他呼吸系統(tǒng)疾病均排除。本研究均獲家屬和患者同意并簽同意書。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DNA 提取 抽取所有研究對象空腹靜脈血2 ml，于-80℃保存樣本。使用DNA試劑盒(上海遠(yuǎn)見生物科技有限公司，D3392-01)，依說明書操作，提取DNA。DNA濃度檢測提取采用核酸蛋白儀(MPfastprep-24)，DNA樣本在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴(kuò)增 引物按照Primer 5.0以及Oligo 6軟件設(shè)計(jì)，IL-18基因-607位點(diǎn)、-137位點(diǎn)的特異性引物，見表1。

表1引物序列信息

Tab.1Primersequence

GenePrimer sequencLocus -607Forward5′- GTTGCAGAAAGTGTAAAAATTATTAC-35′-GT-TGCAGAAAGTGTAAAAATTATTAA-3′Reverse5′-TAACCTCATTCAGGACT-3 ′Quality control forward5 ′-CTTTGCTATCATTCCAG-3 ′Locus -137Forward5 ′-CCCCAACTTTTACGGAAGAAAAG-3 ′5 ′-CCCCAACTTTTACGGAAGAAAAC-3 ′Reverse5 ′-AGGAGGGCAAAATGCACTGG-3Quality control forward5 ′-CCAATAGGACTGATTATTCCGCA-3 ′

1.2.3測定血清IL-18水平 采集研究對象的空腹靜脈血2 ml，血清離心備用，以-80℃保存。參照ELISA試劑盒(北京奧維亞生物技術(shù)有限公司)說明書測定血清IL-18水平。

2 結(jié)果

2.1測序和分型結(jié)果

2.1.1IL-18/-137G/C、-607C/A 基因分型PCR產(chǎn)物測序圖 向反應(yīng)體系中放入的引物為通用反向引物和內(nèi)參照正向引物，在相同的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR成功后，進(jìn)行基因測序。IL-18-607C/A測序結(jié)果，IL-18-137G/C基因分型PCR反應(yīng)產(chǎn)物測序結(jié)果見圖1和圖2。

2.1.2IL-18基因多態(tài)性位點(diǎn)(IL-18/-607C/A，IL-18/-137G/C)電泳結(jié)果 IL-18基因-607位點(diǎn)、137位點(diǎn)的PCR總體系分別為25 μl，其中包括0.25 mmol/L dNTP，約30 ng的基因組DNA和1U Taq聚合酶，10×PCR緩沖液2.5 μl(含2.0 mmol/L MgCl2)。0.4 μmol/L特異性正向引物，0 .4 μmol/L質(zhì)控正向引物，0.8 μmol/L共同反向引物。擴(kuò)增參數(shù)：先預(yù)變性94℃ 4 min后相同溫度變性20 s，然后退火62℃ 40 s，再延伸40 s溫度控制在72℃，總計(jì)7個(gè)循環(huán)；再變性20 s溫度控制為94℃，55℃退火40 s，然后72℃延伸40 s，總計(jì)35個(gè)循環(huán)。將特異性正向引物分別擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物2條進(jìn)行電泳(在瓊脂糖凝膠上20 g/L)，40 min，80 V，采用溴化乙錠染色，觀察結(jié)果和鑒定基因型采用紫外線凝膠成像系統(tǒng)。我們每份標(biāo)本的PCR均分別采用兩條特異性正向引物做兩管，301 bp為質(zhì)控條帶處，196 bp為A/C等位基因特異性擴(kuò)增片段處。

圖3為IL-18 基因-607位點(diǎn)多態(tài)性檢測結(jié)果。標(biāo)本1、2只觀察到長196 bp特異性擴(kuò)增片段在C等位基因處,其基因型為CC；標(biāo)本3、4長196 bp特異性擴(kuò)增片段均可在PCR產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)，其為CA基因型；標(biāo)本5長196 bp特異性擴(kuò)增片段均可在A 等位基因處再現(xiàn)，其為AA基因型。

圖4為標(biāo)本 IL-18/-137位點(diǎn)多態(tài)性檢測電泳結(jié)果，質(zhì)控條帶在446 bp 處,G/C 等位基因特異性擴(kuò)增片段為261 bp處。標(biāo)本2、4、5只在G等位基因處觀察到長261 bp特異性擴(kuò)增片段,為GG基因型;標(biāo)本3長261 bp特異性擴(kuò)增片段在PCR產(chǎn)物電泳后可見，其為GC基因型；標(biāo)本6為261 bp特異性擴(kuò)增片段只在C等位基因處觀察到，為CC基因型。

2.2IL-18基因多態(tài)性位點(diǎn)(IL-18/-607C/A，IL-18/-137G/C)的基因型及等位基因頻率分布及影響哮喘風(fēng)險(xiǎn)基因 遺傳平衡定律經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)后全部符合該定律(P>0.05)，顯示兩組都具備群體代表性。與對照組相比IL-18基因(-607C/A)、3種基因型、等位基因等差異較大(P<0.05)，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。差異性風(fēng)險(xiǎn)因子OR>1，這種情況的等位基因患病風(fēng)險(xiǎn)加大；哮喘組基因位點(diǎn)-137G/C的CC與GG基因型差異較大，對比差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023，P<0.05)，其等位基因頻率則差異較小，比較差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.054，P>0.05)。見表2。

圖1 IL-18/-607C/A多態(tài)性位點(diǎn)測序圖Fig.1 IL-18/-607C/A polymorphism site sequencing diagramNote: The polymorphic loci of IL-18/-607C/A were AC type，CC type and AA type.

圖2 IL-18/-137G/C多態(tài)性位點(diǎn)測序圖Fig.2 Sequence map of IL-18/-137G/C polymorphic lociNote: The polymorphism of IL-18/-137G/C locus is classified into GG type，GC type and CC type.

2.3哮喘組與健康組兩組不同IL-18水平對比 對照組IL-18水平(457.00±82.11)pg/ml高于哮喘組患者(48.68±7.03)pg/ml，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=85.34，P<0.001),說明血清中IL-18的水平與哮喘相關(guān)(圖5)。

2.4不同基因型患者IL-18水平變化比較 哮喘患者血清IL-18的基因多態(tài)性位點(diǎn)(-607C/A)基因型AA與CC型差異極大(P<0.01)，比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示AA基因有增加患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)。哮喘患者血清IL-18基因多態(tài)性位點(diǎn)(-137G/C)3種基因型差異較小(P>0.05)，比較差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

圖3 IL-18/-607C/A位點(diǎn)多態(tài)性電泳圖譜Fig.3 Polymorphism of IL-18/-607C/A locusNote: M.Standard reference material;1，2.CC genotype;3，4.CA genotype;5.AA genotype.

圖4 IL-18/-137G/C位點(diǎn)多態(tài)性電泳圖譜Fig.4 Polymorphism of IL-18/-137G/C locusNote: M.Standard reference materials；1.Negative control；2，4，5.GG genotype;3.GC genotype;6.CC genotype.

表2IL-18基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布[n(%)]

Tab.2GenotypeandallelefrequencydistributionofIL-18genepolymorphicloci[n(%)]

SNPAsthma group(%)Healthy group(%)OR (95% CI)PIL-18/-607C/AAlleleC309(51.3)349(60.6)1A293(48.7)227(39.4)1.458(1.157-1.837)0.002GenotypeCC73(24.3)136(47.2)1AC163(54.1)77(26.7)3.944(2.662-5.842)<0.001AA65(21.6)75(26.1)1.615(1.043-2.500)0.031AC+AA228(75.7)152(52.8)2.795(1.968-3.969)<0.001IL-18/-137G/CAlleleC69(11.5)88(15.3)1G533(88.5)488(84.7)1.393(0.993-1.954)0.054GenotypeCC4(1.3)11(3.8)1GC41(13.6)68(23.6)1.507(0.443-5.120)0.508GG256(85.0)209 (72.6)4.063(1.104-14.96)0.029GC+GG297(98.7)278(96.2)2.671(0.828-8.617)0.088

圖5 哮喘組和健康組外周血IL-8水平比較Fig.5 Comparison of IL-8 levels in peripheral blood of asthma group and healthy group

表3不同基因型患者IL-18水平變化比較(pg/ml)

Tab.3ComparisonofIL-18levelsindifferentgenotypes(pg/ml)

SNPIL-18FPIL-18/-607C/ACC18.02±3.92AC31.68±7.24213.3<0.001AA41.68±8.08IL-8/-137G/CGG31.51±7.31GC32.58±8.630.2810.755CC28.68±7.24

3 討論

哮喘作為一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，遷延難愈，治療困難，不僅對患者的生活質(zhì)量造成了影響，還給患者造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前世界上哮喘患病率在各國不斷升高[10]，生活環(huán)境及基因與哮喘病的發(fā)生關(guān)系密切[11]。

免疫球蛋白E(IgE)和T輔助細(xì)胞2型(TH2)細(xì)胞因子(包括IL-4、IL-5和IL-13)的過度產(chǎn)生可導(dǎo)致過敏性疾病。在哮喘發(fā)病機(jī)制中IL-4發(fā)揮著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用，它在與對應(yīng)的受體結(jié)合后通過轉(zhuǎn)錄激活子6(STAT6)與信號傳導(dǎo)子的磷酸化介導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的DNA轉(zhuǎn)錄，相應(yīng)的細(xì)胞從而產(chǎn)生。在Th2細(xì)胞的分化和IgE的類別轉(zhuǎn)換過程中，IL-4與 STAT6不可缺少[12]。IL-18可促進(jìn)肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞分泌Th2細(xì)胞因子，同時(shí)可增加CD4+T細(xì)胞IL-4和STAT6依賴性方式IgE的產(chǎn)生。IL-18和T細(xì)胞受體介導(dǎo)的刺激可以誘導(dǎo)幼稚CD4+T細(xì)胞在體外發(fā)育成IL-4產(chǎn)生細(xì)胞。Th1/Th2 細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子不平衡是哮喘發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。有學(xué)者證實(shí)，在哮喘患者血清中Th2類細(xì)胞因子IL-13、IL-4 等高表達(dá)，而IL-12、IL-2等Th1類細(xì)胞因子表達(dá)減弱明顯。IL-18則能促進(jìn) T 細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等分泌IL-4、IL-13，同時(shí)增強(qiáng)Th1免疫應(yīng)答[13]，Ghoreschi等[14]研究表明 IL-18 基因多樣性與哮喘的惡化程度密切相關(guān)。這與IMBOD等[15]研究的關(guān)于過敏性哮喘和IL-18基因啟動子1-137等位基因有關(guān)相符，且認(rèn)為IL-18基因變異是過敏性哮喘重要遺傳決定因素。

本研究顯示對照組IL-18水平(457.00±82.11)pg/ml高于哮喘組患者(48.68±7.03)pg/ml，說明血清中IL-18的水平與哮喘相關(guān)；同時(shí)對IL-18編碼基因-137G/C、-607C/A多態(tài)性的分析結(jié)果表明，哮喘患者血清IL-18的基因多態(tài)性位點(diǎn)(-607C/A)基因型AA與CC型差異極大(P<0.01)，比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示AA基因有增加患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)；表明攜帶AA基因型的人群患哮喘風(fēng)險(xiǎn)更大。這與楊慧等[16]提出IL-18在哮喘和過敏性鼻炎發(fā)病機(jī)制中所起的作用相符。

綜上，哮喘患者血清IL-18表達(dá)水平降低，提示患者血清IL-18水平低下與哮喘的發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切。IL-18多態(tài)性位點(diǎn)(IL-18/-607C/A，IL-18/-137G/C)的基因分型中攜帶(-607C/A)AA基因型的人群患哮喘風(fēng)險(xiǎn)更大。但考慮遺傳因素、種族差異、環(huán)境因素、地域差異、樣本大小之間有著復(fù)雜的相關(guān)性等原因，還需要進(jìn)一步大樣本、多中心的開展研究揭示哮喘的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供循證學(xué)依據(jù)。