馮玉，田宇柔，2，3，高樂，2，3，范帥帥，李軍山，牛麗穎，2，3*

1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091；2.河北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050091；3.河北省高校中藥配方顆粒應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050091；4.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430

合歡花為豆科植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥花絮或花蕾，味甘，性平。歸心、肝經(jīng)，具有解郁安神的功能，用于心神不安、憂郁失眠[1]。合歡花具有多種化學(xué)成分，其主要成分為黃酮類，其次為揮發(fā)油類及其他化學(xué)成分[2]。黃酮類化合物如槲皮苷是合歡花的主要有效成分，現(xiàn)代研究多以總黃酮和槲皮苷作為合歡花的指標(biāo)成分[3]。迄今從合歡花中獲得的黃酮類化合物包括山柰酚、槲皮素、異鼠李素、木犀草素、槲皮苷、異槲皮苷、蘆丁等，其中以槲皮苷含量最高[4]。此外，合歡皮中還含有α-菠甾醇、α-菠甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、鞣質(zhì)等。合歡花有一定的食療作用，對(duì)肥胖、抑郁癥、失眠有較好療效，并具有清除自由基的作用，合歡花提取物對(duì)一般常見的海洋致病菌有較好的抑菌作用，水煎液能起到鎮(zhèn)靜催眠的作用[5-6]。

中藥是中華民族的瑰寶，我們應(yīng)該深入研究、大力宣傳中醫(yī)藥文化[7]。中藥配方顆粒是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下把單位藥飲片經(jīng)現(xiàn)代科學(xué)提取、濃縮、干燥制粒，其作為一種新型的中藥飲片改進(jìn)劑型，保留了中醫(yī)隨癥加減的辨證論治，又為不方便煎煮的患者提供了方便，并且質(zhì)量可控，具有安全、起效快、易吸收、使用方便等的優(yōu)點(diǎn)[8]。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局為了規(guī)范配方顆粒的管理，起草了《中藥配方顆粒管理辦法》，國(guó)家藥典委員會(huì)隨后發(fā)布了《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》，并提出標(biāo)準(zhǔn)湯劑的一詞，規(guī)定了中藥配方顆粒的所有藥學(xué)研究均應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行比對(duì)，保證兩者質(zhì)量一致性[9]。工藝參數(shù)的確定，為中藥標(biāo)準(zhǔn)化提供了基礎(chǔ)，有利于促進(jìn)用藥質(zhì)量提高，保證用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性[10]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)合歡花中含量最高的物質(zhì)槲皮苷進(jìn)行含量測(cè)定，并進(jìn)行了指紋圖譜的研究，旨在為合歡花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀UPLC(waters)；島津高效液相色譜儀。

1.2 試藥

槲皮苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111538-201105)；合歡花對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121010-201504)；乙腈、甲醇(Fisher，色譜純)；水(超純水)；其他試劑均為分析純。

15批合歡花飲片經(jīng)神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司質(zhì)量檢測(cè)中心鑒定符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》“合歡花”項(xiàng)下規(guī)定。產(chǎn)地及批號(hào)見表1。

表1 合歡花飲片來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

稱取合歡花飲片100 g，煎煮兩次，第一煎加12倍水，第二煎加10倍水，第一次煎煮前浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸30 min；二煎文火保持微沸20 min，用200目篩網(wǎng)趁熱分離，合并煎液，冷卻，60 ℃真空減壓濃縮并測(cè)定流浸膏的密度、pH值，制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末，計(jì)算出膏率。

表2 合歡花標(biāo)準(zhǔn)湯劑測(cè)定

2.2 槲皮苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：島津wondasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸(23∶77)為流動(dòng)相；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為256 nm。色譜圖見圖1。

注：A.槲皮苷對(duì)照品；B.合歡花標(biāo)準(zhǔn)煎液。圖1 槲皮苷對(duì)照品及合歡花標(biāo)準(zhǔn)煎液HPLC圖

2.2.2 供試品溶液的制備 取2.1項(xiàng)下所得干膏粉約0.1 g，精密稱定置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱重，超聲處理10 min，稱重，用稀乙醇補(bǔ)重，濾過，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮苷對(duì)照品適量，用甲醇溶解得質(zhì)量濃度為0.087 5 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.3項(xiàng)下槲皮苷對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(μg)對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=2.929 8×106X-5.263 1×104，r=0.999 4，表明槲皮苷在0.175 0～1.225 0 μg線性關(guān)系良好。

2.2.4.2 精密度試驗(yàn) 取槲皮苷對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定槲皮苷的峰面積，結(jié)果RSD為0.65%(n=6)，說明儀器精密度良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液5 μL，依照2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、8、12、14、18、22 h測(cè)定槲皮苷峰面積，計(jì)算峰面積RSD為0.62%(n=6)，說明槲皮苷在22 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批干膏粉6份，每份0.1 g，按樣品測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得供試品溶液中槲皮苷含量RSD為1.03%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 稱取同一批干膏粉6份，每份約0.05 g，精密加入一定體積的槲皮苷對(duì)照品溶液，以本法測(cè)定槲皮苷含量并計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為102.19%(n=9)。

2.3 樣品測(cè)定

采用確定的色譜條件測(cè)定15批合歡花藥材和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中槲皮苷的含量。結(jié)果見表3。

表3 合歡花標(biāo)準(zhǔn)湯劑槲皮苷含量、轉(zhuǎn)移率考察

2.4 特征圖譜

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，0.2%磷酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～7 min，15%A；7～8 min，15%～16%A；10 min，16%A；10～11 min，16%～17%A；11～12 min，17%～18%A；12～13 min，18%～20%A；13～15 min，20%～25%A；17 min，25%A；17～18 min，25%～15%A；20 min，15%A)；流速：0.3 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。在此色譜條件下，各色譜峰與相鄰峰的分離度良好且峰形對(duì)稱。

注：A.合歡花標(biāo)準(zhǔn)煎液對(duì)照?qǐng)D譜；B.15批合歡花標(biāo)準(zhǔn)煎液特征圖譜。圖2 合歡花對(duì)照?qǐng)D譜及標(biāo)準(zhǔn)煎液UPLC圖

2.4.2 對(duì)照品溶液制備 選用本品所含主要成分槲皮苷作為參照物。精密稱取槲皮苷對(duì)照品適量，加無(wú)水乙醇配置成質(zhì)量濃度為0.087 5 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取2.1項(xiàng)下所得干膏粉約0.1 g，精密稱定置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱重，超聲處理10 min，稱重，用稀乙醇補(bǔ)重，濾過，即得。

2.4.4 方法學(xué)考察

2.4.4.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一批干粉(批號(hào)1706055)約0.1 g，按2.4.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液1 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各相對(duì)峰面積的RSD值為0.22%，表明本法共有峰的RSD均小于5%，儀器精密度良好

2.4.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批干粉(批號(hào)1706055)約0.1 g，按2.4.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣量為1 μL，分別在0、3、6、9、12 h進(jìn)樣，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各峰相對(duì)峰面積的RSD值均小于5%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批干粉(批號(hào)1706055)樣品約0.1 g，共6份，按2.4.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣量為1 μL，依照2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果表明，本法共有峰的RSD均小于5%，重復(fù)性良好。

2.4.5 特征圖譜的建立 制備15批合歡花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的供試品溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得到15批合歡花標(biāo)準(zhǔn)煎液的特征圖譜，并對(duì)色譜圖進(jìn)行匹配(采用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”)，見圖3，相似度結(jié)果見表4。由匹配圖譜可以看出在合歡花標(biāo)準(zhǔn)湯劑中共標(biāo)定出5個(gè)共有峰，色譜峰相似度分析結(jié)果表明，15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)照?qǐng)D譜之間相似度均在0.9以上，表明15批合歡花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

圖3 15批合歡花標(biāo)準(zhǔn)煎液特征圖譜

批號(hào)170604117060421706043170604417060451706046170604717060481706049170605117060521706053170605417060551706056對(duì)照?qǐng)D譜17060411.0000.9490.9200.9710.9990.9790.9760.9720.9490.9680.9780.9710.9840.9790.9560.98117060420.9491.0000.9310.9580.9550.9670.9600.9210.9700.9670.9520.9620.9230.9630.9410.97317060430.9200.9311.0000.8710.9310.9350.9520.8800.9860.9820.9710.9410.9940.9230.9720.97017060440.9710.9580.8711.0000.9690.9810.9650.9750.9130.9350.9480.9770.8500.9900.9410.96317060450.9990.9550.9310.9691.0000.9790.9770.9710.9590.9750.9830.9740.9070.9790.9600.98617060460.9790.9670.9350.9810.9791.0000.9960.9600.9530.9650.9750.9890.9170.9950.9800.98817060470.9760.9600.9520.9650.9770.9961.0000.9470.9630.9700.9790.9870.9380.9900.9880.99117060480.9720.9210.8800.9750.9710.960.9471.0000.9040.9430.9660.9630.8430.9730.9410.95917060490.9490.9700.9860.9130.9590.9530.9630.9041.0000.9920.9760.9610.9800.9450.9670.98417060510.9680.9670.9820.9350.9750.9650.9700.9430.9921.0000.9940.9730.9670.9620.9770.99317060520.9780.9520.9710.9480.9830.9750.9790.9660.9760.9941.0000.9810.950.9750.9860.99517060530.9710.9620.9410.9770.9740.9890.9870.9630.9610.9730.9811.0000.9290.9930.9870.99017060540.8940.9230.9940.8500.9070.9170.9380.8430.9800.9670.9500.9291.0000.9050.9610.95517060550.9790.9630.9230.9900.9790.9950.9900.9730.9450.9620.9750.9930.9051.0000.9780.98617060560.9560.9410.9720.9410.9600.9800.9880.9410.9670.9770.9860.9870.9610.9781.0000.989對(duì)照?qǐng)D譜0.9810.9730.9700.9630.9860.9880.9910.9590.9840.9930.9950.9900.9550.9860.9891.000

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以出膏率及有效成分即槲皮苷的含量為衡量指標(biāo)，分別對(duì)合歡花標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝的吸水率、加水量、煎煮時(shí)間、靜置時(shí)間、篩網(wǎng)目數(shù)、濃縮溫度進(jìn)行了單因素考察，最后優(yōu)選出最佳制備工藝，并且對(duì)標(biāo)準(zhǔn)煎液進(jìn)行了出膏率、有效成分轉(zhuǎn)移率、特征圖譜的測(cè)定，其出膏率、含量、轉(zhuǎn)移率均在規(guī)定的范圍內(nèi)。

中藥指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制中占有很重要的地位，因?yàn)橹兴幖捌渲苿┦且云湔w作為有效物質(zhì)，中藥指紋圖譜能全面反映中藥內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而反映中藥的質(zhì)量，符合中醫(yī)中藥整體性和模糊性的特點(diǎn)，在中藥質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和控制方面被認(rèn)為是中藥質(zhì)量控制的里程碑[11-12]。本研究采用UPLC建立了合歡花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜，標(biāo)定出含槲皮苷在內(nèi)的5個(gè)共有峰，對(duì)15批合歡花飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，其相似度均大于0.90，表明15批合歡花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量穩(wěn)定性良好。對(duì)指紋圖譜所用的液相色譜方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，其重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性的RSD值均小于5%，表明此方法可用于合歡花飲片及配方顆粒的質(zhì)量控制，為合歡花標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和臨床用藥提供了科學(xué)的數(shù)據(jù)和多角度的研究思路。