姜源明，俸祥仁，蘭宗寶，陳德元，趙 武，劉 偉，銀慧慧，孫建華

(1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西南寧強(qiáng)微農(nóng)牧科技有限公司，廣西 南寧 530001；3.廣西百朋種畜場，廣西 柳州 541502；4.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)科技信息研究所，廣西 南寧 530007)

隨著現(xiàn)代化社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量安全要求越來越高，但這與養(yǎng)殖業(yè)中濫用抗生素的現(xiàn)象存在較大矛盾。為了防治動物疾病，畜牧養(yǎng)殖業(yè)中不可避免地使用抗生素，但仍然難以抵御各種傳染病和新疾病的干擾，尤其是某些病原菌產(chǎn)生耐藥性后，養(yǎng)殖戶通常加大用藥劑量或頻繁更換藥物，致使畜禽產(chǎn)品中的藥殘超標(biāo)，給畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全和公共衛(wèi)生安全帶來了風(fēng)險隱患[1]。中藥是天然藥物，具有毒副作用小且不易產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點(diǎn)，是中華民族從無數(shù)應(yīng)用實(shí)踐中篩選并確定對動物有益無害的外源性精華物質(zhì)，其組成成分可分為2大類[2]：(1)營養(yǎng)成分，如淀粉、蛋白、氨基酸、纖維素、脂肪、維生素等；(2)活性成分，如多糖、低聚糖、生物堿、甙類、酶類、有機(jī)醇、鞣質(zhì)、多酚類、色素和揮發(fā)油等。為了提升畜禽養(yǎng)殖行業(yè)的健康發(fā)展，滿足市場對供應(yīng)安全畜禽產(chǎn)品的需求，中藥在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛[3]，主要通過飲水、飼喂、飼料添加或藥物注射等途徑用于實(shí)際生產(chǎn)，既可預(yù)防和治療疾病，又能促進(jìn)動物生長，且不會因藥物在肉、蛋、奶等畜禽產(chǎn)品中殘留而危害人體健康[4]。為此，本研究通過藥敏試驗篩選出能有效防治豬場常見病原菌的單味中藥，并測定了中藥兩兩組合聯(lián)用的抑菌活性，根據(jù)聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)評價了其聯(lián)合效應(yīng)，旨在為推進(jìn)中藥在畜牧業(yè)中的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大腸桿菌(Escherichiacoli)、巴氏桿菌(Pasteurellasp.)、鏈球菌(Streptococcussp.)、沙門氏菌(Salmonellasp.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和放線桿菌(Actinobacillussp.)等豬場常見病原菌由廣西獸醫(yī)研究所篩選獲得，使用前將保存于斜面培養(yǎng)基上的菌種接種至適宜的營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，然后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩趺?、大黃、桂枝、黃芩、秦皮、板藍(lán)根、穿心蓮、決明子、黃柏、蒲公英、知母、梔子、黃連、金銀花、大青葉、紫花地丁、龍膽草、白頭翁、敗醬草、牡丹皮、夏枯草、苦參、土茯苓、青蒿、連翹、野菊花、石斛、杜仲、柴胡、訶子、白鮮皮、茵陳、虎杖、魚腥草、桑葉、甘草、大青葉、黃芪、地榆、半枝蓮、赤芍、白術(shù)、防風(fēng)、黨參、石榴皮、白扁豆、鳳尾草、馬齒莧、五倍子等中藥飲片購自廣西玉林市中藥材專業(yè)市場，醡漿草采摘于廣西藥用植物園。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試驗藥材的處理

醡漿草于清晨采摘新鮮原草，以研缽將原草研碎后用紗布過濾，收集濾液置于離心管中，4000 r/min離心20 min，取上清液濃縮，裝瓶備用。準(zhǔn)確稱取烏梅、大黃、黃芩、秦皮、板藍(lán)根、黃柏、蒲公英、知母、梔子、黃連、金銀花、大青葉、紫花地丁、龍膽草、白頭翁、敗醬草、牡丹皮、夏枯草、苦參、土茯苓、仙鶴草、連翹、野菊花、石斛、杜仲、柴胡、訶子、白鮮皮、茵陳、虎杖、桑葉、甘草、大青葉、黃芪、地榆、半枝蓮、赤芍、白術(shù)、防風(fēng)、黨參、石榴皮、白扁豆、鳳尾草、馬齒莧、五倍子各50.0 g，置于煎煮容器內(nèi)，加入5～7倍蒸餾水浸泡1～2 h，煎煮30 min后收集藥液，藥渣再加入3～5倍蒸餾水繼續(xù)煎煮20 min，合并2次藥液后濃縮至生藥含量為1.0 g/mL，4000 r/min離心20 min，取上清液裝瓶備用。穿心蓮、桂枝、決明子、金銀花和魚腥草用適量的95%乙醇浸泡6～8 h，收集浸提液，藥渣再用95%乙醇浸泡4～6 h，合并浸提液后于80 ℃加熱回流1.5～2.0 h，收集浸提液，過濾，濃縮至生藥含量1.0 g/mL，裝瓶備用。全部藥液需經(jīng)121 ℃滅菌15～20 min，取出冷卻后置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 藥敏試驗

以無菌棉簽蘸取目標(biāo)菌液均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，用直徑6 mm的打孔器在培養(yǎng)基上等距離打孔6個，每孔加入中藥提取液0.2 mL，每種藥液設(shè)3個平行，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，測量抑菌圈直徑。體外抑菌定性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑小于10.00 mm為耐藥(不敏感)，10.00～15.00 mm為中度敏感，15.00 mm以上為高度敏感。

1.4 藥物最小抑菌濃度(MIC)試驗

采用試管二倍稀釋法：(1)取11支帶有滅菌棉塞的試管，編號后排列在試管架上。向每支試管中加入無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2.0 mL，然后在第1支試管中加入滅菌的中藥藥液2.0 mL，混勻后取出2.0 mL放入第2支試管中，以此類推，直到第9支試管取出2.0 mL棄除，即配成含中藥提取物分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等梯度濃度的藥液(表1)。第10支試管不加任何藥物作為對照，以觀察培養(yǎng)基是否適合于菌株生長。第11支試管加受試中藥藥液2.0 mL，混勻后棄除2.0 mL，不接種菌株，以觀察受試中藥是否受污染。(2)將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)6～8 h的菌液用無菌營養(yǎng)肉湯進(jìn)行1000倍液稀釋，然后取0.1 mL菌液分別加入到第1～10支試管中，混勻，37 ℃培養(yǎng)16～24 h后觀察結(jié)果。若肉湯混濁，表示細(xì)菌生長；若肉湯完全清亮，表示無細(xì)菌生長。(3)將未見細(xì)菌生長的營養(yǎng)肉湯轉(zhuǎn)種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，仍無細(xì)菌生長，即該試管對應(yīng)的藥量就是受試中藥的最小抑菌濃度(MIC)。

表1 中藥提取物抑菌濃度與對應(yīng)的藥物稀釋倍數(shù)關(guān)系

1.5 聯(lián)合用藥效果評價

以大腸桿菌為供試菌株，采用微量棋盤稀釋法對中藥兩兩組合進(jìn)行二倍倍比稀釋，藥物互作效應(yīng)通過計算其部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)來判斷，具體操作及判定標(biāo)準(zhǔn)參照NCCLS[5-6]。

FICI=MICA聯(lián)/MICA+MICB聯(lián)/MICB

其中，A表示抗菌藥，B表示原兒茶酸或綠原酸。判定標(biāo)準(zhǔn)：FICI≤0.50表現(xiàn)為協(xié)同作用，0.50

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗結(jié)果

由表2可知，烏梅、大黃、黃芩、金銀花、連翹、野菊花和五倍子對大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和放線桿菌等6種豬場常見病原菌均表現(xiàn)為高度敏感；桂枝、板藍(lán)根、訶子和魚腥草對6種豬場常見病原菌具有抑菌作用，或呈高度敏感，或呈中度敏感；蒲公英、知母、敗醬草、仙鶴草、石斛、柴胡、白鮮皮、桑葉、地榆、半枝蓮、防風(fēng)和白扁豆對6種豬場常見病原菌呈耐藥性；其余中藥對6種豬場常見病原菌的抑菌效果不一致，對個別病原菌有良好的抑菌效果。

2.2 藥物MIC測定結(jié)果

由表2和表3可知，50味中藥對6種豬場常見病原菌的MIC與其藥敏試驗結(jié)果基本吻合。以烏梅、大黃、桂枝、金銀花、連翹、野菊花和五倍子等7味中藥對6種豬場常見病原菌的MIC較低，故選取這7味中藥進(jìn)行聯(lián)合用藥試驗。其中，烏梅對6種豬場常見病原菌的MIC分別為31.25、3.90625、7.8125、15.625、3.90625和7.8125 mg/mL，大黃對6種豬場常見病原菌的MIC分別為62.5、31.25、7.8125、62.5、7.8125和15.625 mg/mL，桂枝對6種豬場常見病原菌的MIC分別為62.5、31.25、31.25、62.5、15.625和15.625 mg/mL，金銀花對6種豬場常見病原菌的MIC分別為15.625、7.8125、31.25、15.625、15.625和31.25 mg/mL，連翹對6種豬場常見病原菌的MIC分別為62.5、15.625、31.25、31.25、62.5和7.8125 mg/mL，野菊花對6種豬場常見病原菌的MIC分別為62.5、7.8125、62.5、15.625、62.5和62.5 mg/mL。

2.3 7味中藥提取物的聯(lián)合抑菌活性

7味中藥兩兩聯(lián)合的抑菌活性結(jié)果見表4，并根據(jù)FICI評價其聯(lián)合效應(yīng)。從表4可看出，烏梅+桂枝、大黃+桂枝、桂枝+連翹、桂枝+野菊花、桂枝+五倍子的FICI>2.00，表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)；烏梅+五倍子、大黃+連翹、大黃+野菊花、大黃+五倍子、金銀花+連翹、金銀花+野菊花、連翹+野菊花的FICI≤0.50，表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)；烏梅+大黃、烏梅+金銀花、烏梅+連翹、烏梅+野菊花、大黃+金銀花、桂枝+金銀花、金銀花+五倍子、連翹+五倍子、野菊花+五倍子的FICI均在0.75～1.00范圍內(nèi)，即0.50

3 討論

中藥是我國特有的天然資源，且具有資源廣、毒副作用低等特點(diǎn)，在治療感染、逆轉(zhuǎn)(或抑制)細(xì)菌耐藥性等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢[2,7-8]，因此尋找既有良好耐藥消除效果又無毒副作用的中藥，對促進(jìn)畜牧業(yè)健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本研究的藥敏試驗結(jié)果表明：烏梅、大黃、黃芩、金銀花、連翹、野菊花和五倍子等7味中藥對大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和放線桿菌等6種豬場常見病原菌均表現(xiàn)為高度敏感；而藥物MIC測定結(jié)果顯示，以烏梅、大黃、桂枝、金銀花、連翹、野菊花和五倍子等7味中藥對6種豬場常見病原菌的MIC較低。綜上所述，烏梅、大黃、金銀花、連翹、野菊花和五倍子等中藥對豬場常見病原菌具有很好的抑菌效果，說明這些中藥具有廣譜殺菌作用，可能與其富含皂甙、黃酮類、有機(jī)酸等多種較強(qiáng)的抗菌成分有直接關(guān)系[9]。

表2 50味中藥對6種豬場常見病原菌的藥敏試驗結(jié)果 mm

注：/表示未見抑菌圈。

與單方藥物相比，復(fù)方制劑具有改善服用藥品依從性、提高藥物療效、減少不良反應(yīng)、降低用藥費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)。我國中醫(yī)臨床學(xué)上素有使用中藥復(fù)方制劑的習(xí)慣，中藥復(fù)方制劑含有多種有效成分，能直接殺滅或抑制病原和增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有毒性低、多靶點(diǎn)、不易產(chǎn)生副作用和耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在抗菌抗病毒的同時還能促進(jìn)動物生長[10]，目前在畜禽養(yǎng)殖業(yè)上已得到廣泛應(yīng)用。本研究以大腸桿菌為供試菌株，以烏梅、大黃、桂枝、金銀花、連翹、野菊花和五倍子為試驗用藥，兩兩配伍后進(jìn)行抑菌活性試驗，并根據(jù)FICI評價其聯(lián)合效應(yīng)。結(jié)果表明：烏梅+五倍子、大黃+連翹、大黃+野菊花、大黃+五倍子、金銀花+連翹、金銀花+野菊花、連翹+野菊花呈協(xié)同效應(yīng)；烏梅+大黃、烏梅+金銀花、烏梅+連翹、烏梅+野菊花、大黃+金銀花、桂枝+金銀花、金銀花+五倍子、連翹+五倍子、野菊花+五倍子呈相加效應(yīng)；而烏梅+桂枝、大黃+桂枝、桂枝+連翹、桂枝+野菊花、桂枝+五倍子呈拮抗效應(yīng)。其中，桂枝除了與金銀花聯(lián)用呈相加效應(yīng)外，與其他中藥聯(lián)用均表現(xiàn)出拮抗效應(yīng)。究其原因可能是桂枝中的某些主要有效成分限制或阻礙了其他中藥有效成分發(fā)揮抑菌作用，但具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

表4 6味中藥兩兩聯(lián)合對大腸桿菌的抑菌活性結(jié)果 mg/mL