楊和川，譚一羅，蘇文英，秦裕營，馬 騰，浦漢春，周振玲

(連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000)

金針菇(Flammulinavelutipes)又名毛柄金錢菌、構(gòu)菌、樸菇、冬菇等，在自然界中分布廣泛，是我國最早開始人工栽培的食用菌之一，具有廣闊的市場前景[1]。金針菇鮮菇的顏色是其銷售的重要分級指標(biāo)之一，早期生產(chǎn)企業(yè)多采用黃色金針菇菌種，但由于黃色金針菇菌株在栽培中易發(fā)生褐變等問題，嚴(yán)重影響了金針菇的品質(zhì)、銷售及加工。因此，近年來金針菇工廠化生產(chǎn)企業(yè)均以白色金針菇的生產(chǎn)為主[2-3]。由于金針菇可以通過無性繁殖進行菌種生產(chǎn)，且菌種分離難度低，因此市場上金針菇菌種自行編號或命名現(xiàn)象普遍，菌種生產(chǎn)、銷售混亂，極易出現(xiàn)同種異名、異種同名的情況，既給金針菇生產(chǎn)中菌種管理帶來了困難，又影響了育種者的權(quán)益，同時，劣質(zhì)菌種流入生產(chǎn)還會造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，研究目前市場上白色金針菇種質(zhì)資源的遺傳多樣性，對金針菇的種性鑒定、遺傳育種等基礎(chǔ)科研和產(chǎn)業(yè)體系建立等具有重要意義。

傳統(tǒng)的菌株鑒別方法，如子實體形態(tài)特征和拮抗試驗等易受外界環(huán)境的影響，同一菌株在不同栽培條件下表現(xiàn)出較大的差異，不能鑒別出親緣關(guān)系較近的菌株[4-6]。近年來，DNA指紋技術(shù)被廣泛應(yīng)用于真菌的系統(tǒng)學(xué)研究及其分類鑒定，隨機擴增多態(tài)性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats，SSR)、簡單重復(fù)序列區(qū)間(Inter-Simple Sequence Repeats，ISSR)、特征性片段擴增區(qū)域(Sequence Characterized Amplified Region，SCAR)等技術(shù)[7-11]在食用菌種質(zhì)資源的評價、菌株鑒別、遺傳多樣性的研究中取得了顯著成效。其中，RAPD分子標(biāo)記技術(shù)具有操作簡便、對基因組DNA濃度和試劑要求低、成本低廉的優(yōu)點。為了避免在實際生產(chǎn)中品種混亂，降低栽培風(fēng)險，本研究對15種白色金針菇菌株進行了RAPD分子標(biāo)記分析，以期為金針菇的種性研究、良種選育及種質(zhì)資源管理提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

15株白色金針菇菌株的編號和來源如表1所示。

表1 供試菌株編號及來源

1.2 試劑和儀器

DreamTaq PCR Master Mix(2×)購自賽默飛世爾科技公司，DNA提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，DNA marker、引物序列購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，其余試劑購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。PCR儀為德國艾本德股份公司產(chǎn)品，電泳儀、電泳槽為伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基

MYG固體培養(yǎng)基：葡萄糖5 g、酵母浸粉5 g、麥芽糖10 g、瓊脂糖15 g、水1000 mL、自然pH值。該培養(yǎng)基用于金針菇菌絲培養(yǎng)。

1.4 試驗方法

1.4.1 總DNA的提取 將供試菌株分別接種于MYG固體培養(yǎng)基平皿，25 ℃恒溫培養(yǎng)10 d，刮取平皿上菌株氣生菌絲體于1.5 mL離心管中，放入液氮研磨成粉末，采用DNA提取試劑盒提取金針菇的基因組DNA，提取的DNA于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 RAPD-PCR的擴增 采用的20條RAPD引物序列見表2。PCR反應(yīng)體系20 μL，包含模板DNA 1 μL、引物1μL、DreamTaq PCR Master Mix(2×)10 μL、ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序：92 ℃預(yù)變性5 min；92 ℃變性1 min；35 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min，循環(huán)40次，72 ℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物于-20 ℃下保存。從20條RAPD引物中篩選譜帶清晰、多態(tài)性豐富的引物，采用1%瓊脂糖凝膠電泳，拍照記錄電泳結(jié)果。

表2 RAPD擴增使用的引物

1.4.3 數(shù)據(jù)處理 對電泳圖譜進行條帶統(tǒng)計，相同位移上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，轉(zhuǎn)換為0/1矩陣。利用NTSYSpc 2.11軟件對0/1矩陣數(shù)據(jù)進行分析，通過非加權(quán)配對算數(shù)平均法(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic means，UPGMA)進行聚類分析,并基于原始0/1矩陣進行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD-PCR擴增

從20條RAPD引物中篩選出8條譜帶清晰、多態(tài)性豐富的引物，分別為引物S43、S75、S79、S80、S90、S484、S1398、S2111。使用這8條引物對15株白色金針菇菌株進行多態(tài)性分析(圖1)，共計擴增出45條片段，其中多態(tài)性片段33條，多態(tài)性比率為73.3%，說明RAPD分子標(biāo)記有較好的多態(tài)性。

1～15為供試菌株編號，與表1中品種編號一致；M為DL2000 Marker。下同。

2.2 供試菌株遺傳相似性分析

通過NTSYSpc 2.11軟件對15株白色金針菇菌株間遺傳相似系數(shù)進行了計算，結(jié)果表明：供試菌株的遺傳相似系數(shù)在0.560～0.984之間，2號菌株與15號菌株的遺傳相似系數(shù)最小，12號菌株與13號菌株的遺傳相似系數(shù)最大，說明2號菌株與15號菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，12號菌株與13號菌株的親緣關(guān)系較近(表3)。

表3 基于RAPD的供試菌株的遺傳相似系數(shù)矩陣

注：1～15為供試菌株編號，與表1中品種編號一致。下同。

2.3 供試菌株UPGMA聚類分析

采用UPGMA法進一步聚類進行分析，構(gòu)建遺傳親緣系數(shù)樹狀圖(圖2)。當(dāng)遺傳相似系數(shù)在0.68時，15株供試菌株被聚為1類；在0.830水平上被聚為4類，其中，類群Ⅰ包含1號和2號菌株；類群Ⅱ包含4、5、10、12、13、11號菌株；類群Ⅲ包含3、8、9號菌株；類群Ⅳ包含6、7、14、15號菌株。

2.4 供試菌株的主成分分析

對15株供試金針菇種質(zhì)的原始矩陣進行主成分分析，第1主坐標(biāo)和第2主坐標(biāo)的方差貢獻率分別為45.31%和15.40%，以第1、第2主坐標(biāo)的二維圖排序繪制主成分分析二維聚類圖(圖3)。可以看出，二維聚類圖將15個白色金針菇菌株分為4類，比較圖2和圖3，主成分分析結(jié)果與遺傳相似系數(shù)0.830水平上聚類分析結(jié)果相似，聚類圖中部分菌株間的遺傳多樣性較高，因此對應(yīng)在主成分分析圖中的分布相對分散。

3 討論

利用菌株的拮抗反應(yīng)和農(nóng)藝性狀比較是鑒別食用菌菌株的常見辦法。但是，一方面，遺傳背景相似或親緣關(guān)系很近的菌株則難以區(qū)分，且拮抗試驗不具有傳遞性；另一方面，金針菇子實體農(nóng)藝性狀受環(huán)境因素的影響大，栽培流程復(fù)雜、耗時耗工，因此采用分子生物學(xué)技術(shù)研究金針菇菌株間的親緣關(guān)系成為一種重要方法。其中，RAPD技術(shù)不需要供試菌株的基因組序列信息，而是采用隨機引物，因此，該方法具有流程簡單、成本低廉的優(yōu)勢。

圖2 15株供試菌株的RAPD分子標(biāo)記聚類圖

圖3 供試菌株二維主成分分析圖

基于RAPD技術(shù)對供試菌株進行遺傳多樣性的分析，試驗結(jié)果能明顯反映供試菌株間的遺傳差異和親緣關(guān)系。15株白色金針菇菌株根據(jù)子實體顏色又可以分為乳白色和白色2類，聚類分析結(jié)果雖然可將供試菌株分為4類，但是無法將白色和乳白色菌株子實體按顏色區(qū)分，乳白色金針菇菌株可能來源于不同顏色菌株的雜交。對照UPGMA聚類圖和主成分分析圖，在主成分分析圖中類群Ⅰ和類群Ⅱ能明顯劃分，且類群內(nèi)的菌株分布較近，說明類群內(nèi)菌株的親緣關(guān)系較近，2個類群間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；而類群Ⅲ、類群Ⅳ內(nèi)菌株間分布較分散，說明類群內(nèi)菌株彼此親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，與UPGMA聚類結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明：RAPD分子標(biāo)記是研究金針菇菌株遺傳多樣性的一個有效方法，菌株DNA指紋圖譜的建立對知識產(chǎn)權(quán)保護具有重要意義。但是，單一分子標(biāo)記技術(shù)在計算遺傳相似系數(shù)時存在偏差，因此同時結(jié)合其他分子標(biāo)記技術(shù)綜合分析金針菇菌株的遺傳多樣性，開發(fā)SCAR和SSR等能特異鑒別金針菇菌株的分子標(biāo)記，對金針菇菌株的準(zhǔn)確鑒定、保護知識產(chǎn)權(quán)、育種親本選擇、提高育種效率均具有重要意義。