陳天剛 胡永芳

【摘要】目的：建立流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的方法。方法：利用結(jié)核分枝桿菌水解HDA的特點(diǎn)，選取HDA作為帶有熒光的材料。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)20株結(jié)核分枝桿菌對(duì)RFP，INH，SM和EMB的敏感性。MI值由不同濃度藥物影響細(xì)菌后培養(yǎng)物檢測(cè)到的平均熒光強(qiáng)度與陽(yáng)性對(duì)照的比值來(lái)推斷[1]：20株結(jié)核分枝桿菌的流式細(xì)胞儀藥敏試驗(yàn)結(jié)果與比例法基本一致。結(jié)論：建立流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌藥敏具有快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床結(jié)核分枝桿菌藥敏的檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌;微生物敏感性試驗(yàn);流式細(xì)胞術(shù)

【中圖分類號(hào)】R378.911【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1005-0019（2019）02-056-01

結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。近年來(lái)，世界上結(jié)核病的發(fā)病率明顯增加，中國(guó)也不例外。在結(jié)核病控制過(guò)程中，結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，尤其是耐多藥結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，已成為結(jié)核病預(yù)防工作的嚴(yán)重障礙。耐多藥結(jié)核分枝桿菌（MDR-TB）與非標(biāo)準(zhǔn)臨床治療密切相關(guān)，需要快速、靈敏的藥物檢測(cè)方法。建立結(jié)核分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)是有效控制結(jié)核病的重要方法。目前，比例法已廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)。這種方法在分離菌株后獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果需要四周的時(shí)間。在二十世紀(jì)八十年代建立的BACTECTB 460分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的BACIECMG TI960可縮短獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果的時(shí)間到5-8天，但存在要求特殊儀器、試劑比較昂貴、有一定的污染率等缺點(diǎn)。近年來(lái)，隨著流式細(xì)胞儀器在醫(yī)院中的普及，流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)菌藥敏試驗(yàn)中的應(yīng)用得到了很大的發(fā)展。細(xì)菌與熒光染料的結(jié)合程度可判斷細(xì)菌的活性。快速藥物敏感性試驗(yàn)具有重要意義。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)已取得一定進(jìn)展。然而，中國(guó)卻沒(méi)有媒體報(bào)道這一點(diǎn)[2]我們對(duì)此進(jìn)行了研究。研究過(guò)程和結(jié)果如下：

1材料

1.1 菌株 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株，以及于2018年1月至2018年2月在重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室采集到的臨床分離株，鑒定出20株結(jié)核分枝桿菌，其中10株為耐多藥結(jié)核分枝桿菌（MDR-TB）。

1.2試劑? 利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、乙酰乙酸熒光素和IMSQ均購(gòu)自Signa，7H9液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司。FDA溶于DMSO，配置為1g/L的溶液，儲(chǔ)存在-20C。

1.3儀器? 流式細(xì)胞儀為BD FACSCalibur型號(hào)，是美國(guó)BD公司制造的。

2方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的藥敏試驗(yàn)? 在羅氏培養(yǎng)基上挑取H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落，在含有玻璃珠的無(wú)菌瓶中磨成干酪樣品。用生理鹽水制備1g/L菌懸液。將1 g/L菌懸浮液稀釋至10-2 g/L細(xì)菌提取物Q1MI，接種到含有不同濃度藥物的7H9液體培養(yǎng)基中。INH的最終濃度為1.25、2.5、5、10、20mg/L，RFP為1.25、2.5、5、10、20mg/L，SM為2、4、8、16、32mg/L，EMB為0.625、1.25、2.5、5、10mg/L，7 H9培養(yǎng)基為空白對(duì)照。然后將8%多聚甲醛添加到FDA37℃培養(yǎng)30min，用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)確定最終和平均熒光強(qiáng)度。

2.2臨床菌株的藥敏試驗(yàn)? 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)菌株藥敏試驗(yàn)，篩選出檢測(cè)臨床菌株的最佳實(shí)驗(yàn)方案。將20株臨床分離的結(jié)核分枝桿菌接種于含不同藥物濃度的7H9液體培養(yǎng)基中，最終INH濃度為2.5、5、10mg/L，RFP為5、10、20mg/L，SM為8、16、32mg/L，EMB為1.25、2.5、5 mg/L，在37℃培養(yǎng)72h，分別加入終濃度為250Lg/L的FDA 37℃孵育30min， 加入8%多聚甲醛處理40min，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)菌的平均熒光強(qiáng)度。

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)? 首先，利用熒光微球?qū)x器的光路和液體流動(dòng)系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)定，確保儀器各項(xiàng)指標(biāo)均在允許范圍內(nèi)，并將前角（FSC）和側(cè)角（SSC）的信號(hào)值設(shè)定為對(duì)數(shù)a。美化。根據(jù)FSC/SSC的信號(hào)調(diào)節(jié)電壓，以發(fā)現(xiàn)最集中的細(xì)菌。通過(guò)直方圖計(jì)算FDA在FL通道上的平均熒光強(qiáng)度（MF I），最低抑菌濃度（MIC）。通過(guò)比較藥物管與不含藥物的陽(yáng)性對(duì)照管的MF的60%或更多來(lái)確定。

2.4比例法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)? 參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》91操作。

2.5統(tǒng)計(jì)分析? 使用? SPS91.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，配對(duì)資料采用X2檢驗(yàn)，RQ05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間的對(duì)照結(jié)果，可以看出培養(yǎng)時(shí)間為72個(gè)小時(shí)最為適宜，在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)臨床株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與絕對(duì)濃度法結(jié)果比較上，我們可以發(fā)現(xiàn)通過(guò)這兩種方法檢測(cè)的結(jié)果沒(méi)有差別。

4討論

FDA是一種無(wú)極性、無(wú)熒光酯，本身不發(fā)熒光，滲入活細(xì)胞后，可被胞質(zhì)中的酯酶迅速水解釋放出熒光素，在488mm的藍(lán)光激發(fā)下，發(fā)射出黃綠色的熒光，可經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。? 利用FDA的特點(diǎn)，使之與結(jié)核分枝桿菌作用，該物質(zhì)能穿透活的分枝桿菌細(xì)胞壁并能被胞質(zhì)中的非特異性酯酶迅速水解為游離的熒光素，而死菌和被抗結(jié)核藥物抑制的細(xì)菌因缺乏活性酯酶而不能有效地水解FDA游離熒光素產(chǎn)生會(huì)相應(yīng)減少，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)帶熒光的分枝桿菌的熒光強(qiáng)度的變化來(lái)推斷MIC獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果[3]首先建立了結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37R的流式藥敏試驗(yàn)方法，藥物和細(xì)菌作用后我們可以得到結(jié)果，結(jié)果和狀態(tài)或與樣品的處理有關(guān)。在試驗(yàn)過(guò)程中為防止實(shí)驗(yàn)室污染，保證操作者的安全，上樣前對(duì)樣品用8%的多聚甲醛處理，使結(jié)核桿菌失活，但發(fā)現(xiàn)甲醛的處理后會(huì)使部分試驗(yàn)管的熒光強(qiáng)度有所降低，在一定程度上影響了試驗(yàn)結(jié)果，這一問(wèn)題還有待解決。

5結(jié)語(yǔ)

結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞學(xué)敏感性試驗(yàn)簡(jiǎn)便、快速、靈敏、重復(fù)性好。如果它被發(fā)展成一套成熟的方法，它可以作為一個(gè)常規(guī)的臨床試驗(yàn)來(lái)執(zhí)行。因此，結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的快速檢測(cè)，從28天到2-3天，一方面有利于結(jié)核病的治療，另一方面也能及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐多藥結(jié)核患者，減少結(jié)核患者的傳播。

參考文獻(xiàn)

[1]李慶炎.翟志敏.流式細(xì)胞術(shù)用于念珠菌快速藥敏試驗(yàn)的研究[J]中國(guó)臨床保健雜志201 10（2） 1227-1229.

[2]馬筱玲，李志敏.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗生素最低抑菌濃度[J]中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2016（4）3639-3645.

[3]夏曉華，泉.流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于金黃色葡萄球菌體外藥敏試驗(yàn)的初步研究[J]中國(guó)人獸共患病雜志，20164）5053-5058.