樊鳳嬌， 宋睿， 吳秉毅， 郭躍文， 呂偉標(biāo)， 于新發(fā)△

南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院(佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院) 1血液科， 2產(chǎn)科， 3檢驗科(廣東佛山 528300)

妊娠期女性由于存在高凝狀態(tài)、靜脈淤滯、血管損傷等特殊的生理變化，發(fā)生靜脈栓塞(vnous thromboembolism，VTE)的風(fēng)險增高，其風(fēng)險是同年齡非妊娠婦女的4～5倍，成為發(fā)達國家孕婦死亡最主要的原因[1-3]。妊娠期高凝狀態(tài)生理變化為產(chǎn)后快速有效止血提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，但也容易導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated inravascular coagulation，DIC)的發(fā)生[4]。當(dāng)妊娠合并凝血功能障礙性疾病或妊娠并發(fā)癥導(dǎo)致凝血功能障礙時易引起DIC，進一步引起產(chǎn)后出血(primary postpartum hemorrhage，PPH)。PPH也是我國產(chǎn)婦死亡的首要原因[5]。妊娠期高凝狀態(tài)，導(dǎo)致孕婦不能參照非妊娠人群凝血指標(biāo)的參考區(qū)間，再者，妊娠期凝血級聯(lián)反應(yīng)是漸進性加劇過程[6]，因此應(yīng)針對不同孕期應(yīng)建立相對應(yīng)的參考區(qū)間。目前基本上采用橫斷面研究建立妊娠期凝血功能的參考區(qū)間，無法消除個體差異對研究結(jié)果的影響。本研究旨在采用縱向研究動態(tài)分析妊娠期凝血功能指標(biāo)的變化。D-二聚體(D-Dimer)在“非特殊人群”排除診斷VTE及診斷DIC具有重要價值，但是D-Dimer在診斷孕產(chǎn)婦VTE及DIC中的應(yīng)用仍受到很大限制。所以，我們監(jiān)測了妊娠期間凝血系統(tǒng)的變化，旨在建立妊娠期常規(guī)凝血檢測的參考區(qū)間，并分析D-Dimer在妊娠期VTE和PPH的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康妊娠組：選取2017年1月至2018年2月就診于南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院做產(chǎn)前檢查的健康單胎妊娠婦女691例。納入標(biāo)準(zhǔn)：單胎活產(chǎn)，無孕期合并癥及并發(fā)癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕前或孕期合并高血壓病、糖尿病、惡性腫瘤、肝腎疾病、心腦血管疾病，出凝血性疾病史或家族史，免疫性疾病史，近期3個月服用抗凝藥物，分娩期并發(fā)癥如胎盤早剝、前置胎盤、宮縮乏力、軟產(chǎn)道損傷者，產(chǎn)后出血、羊水栓塞、DIC等。疾病組：選取2010年1月至2018年2月在南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院診斷VTE患者8例，合并凝血功能障礙的產(chǎn)后出血75例。健康對照組：選取同期在南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院體檢的健康育齡非孕婦80名，將其按年齡分組：<35歲組和≥35歲組。健康對照組的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)同健康孕婦組。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及檢測方法 空腹采肘靜脈血2.7 mL于含檸檬酸鈉的抗凝管內(nèi)(含3.2%枸櫞酸溶液0.3 mL)，抗凝劑與靜脈血比例為1∶9，立即混勻，3 000 r/min離心10 min，在SYSMEX-凝血儀上進行測定，在2 h內(nèi)完成檢測，分別統(tǒng)計D-Dimer、纖維蛋白原(FIB)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)的數(shù)值。采集空腹靜脈全血1.0 mL于含EDTA抗凝劑的紫色帽真空抗凝管內(nèi)，在i-CHROMA Reader 免疫熒光分析儀上測定，統(tǒng)計血小板(PLT)計數(shù)。

1.2.2 研究方法 通過縱向研究收集健康單胎妊娠婦女691例及健康育齡非孕婦80例。按照《婦產(chǎn)科學(xué)》第7版孕期分類標(biāo)準(zhǔn)[7]，將691例健康孕產(chǎn)婦分為孕早期、孕中期、孕晚期3組：孕早期(<12周)、孕中期(12～28周)、孕晚期(>28周)。進一步將早、中、晚孕組進行亞組分析，按年齡分為年齡<35歲組和年齡≥35歲組，按產(chǎn)次分為初產(chǎn)婦(產(chǎn)次=1)及經(jīng)產(chǎn)婦(產(chǎn)次≥2)，分析年齡、產(chǎn)次是否是影響各個孕期凝血功能水平的因素。比較孕期D-Dimer、PLT、FIB、APTT、PT、TT水平變化趨勢，并且分析各孕期上述指標(biāo)差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義。同時建立各孕期的D-Dimer、PLT、FIB、APTT、PT、TT指標(biāo)的參考區(qū)間，采用P95表示D-Dimer參考區(qū)間的單側(cè)上限，采用P2.5～P97.5表示FIB、APTT、PT、TT、PLT參考區(qū)間的上下限。采用本研究建立的參考區(qū)間評估8例孕期VTE和75例產(chǎn)后出血合并凝血功能障礙患者的D-Dimer水平，驗證本研究建立參考區(qū)間的有效性。利用ROC曲線評價及分析D-Dimer水平在產(chǎn)后出血的診斷效率，并確定最佳臨界值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，首先采用Q-Q Plots對凝血指標(biāo)正態(tài)性檢驗，D-Dimer、FIB、APTT、PT、TT、PLT均呈正態(tài)性分布。對孕期與D-Dimer、FIB、APTT、PT、TT、PLT水平做Pearman相關(guān)性分析。對于<35歲組、≥35歲組之間凝血指標(biāo)的比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對于初產(chǎn)婦與經(jīng)產(chǎn)婦之間凝血指標(biāo)的比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。不同孕期凝血指標(biāo)的之間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；不同孕期組之間D-Dimer、FIB、APTT、PT、TT、PLT的兩兩比較，當(dāng)有方差齊性時采用LSD檢驗，當(dāng)方差不齊時采用Dunnett′s檢驗，檢驗水準(zhǔn)(0.05)除以3個孕周組間兩兩比較的次數(shù)(3次)而調(diào)整為0.016，即P<0.016為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。D-Dimer參考區(qū)間采用95%作為參考區(qū)間上限；FIB、APTT、PT、TT、PLT的參考區(qū)間采用雙側(cè)百分位數(shù)法表示(P2.5～P97.5)。D-Dimer水平在產(chǎn)后出血的診斷效率分析及評價采用ROC曲線，特異度與敏感度相加最大值為臨床診斷的最佳臨界值。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床資料 691例孕產(chǎn)婦，年齡17～45歲，平均(30.97±4.89)歲。年齡<35歲的524例，年齡17～34歲，平均(28.81±3.28)歲，年齡≥35歲的167例，年齡35～45歲，平均(37.71±2.25)歲。初產(chǎn)婦158例，經(jīng)產(chǎn)婦533例。健康非孕組80例，年齡17～46歲，平均(32.5±5.61)歲。疾病組：靜脈血栓8例年齡22～39歲，平均(32.50±6.03)歲，產(chǎn)后出血75例，年齡22～41歲，平均(32.00±5.11)歲。

2.2 健康妊娠組中年齡、產(chǎn)次與孕期分別對凝血指標(biāo)的影響 在年齡<35歲及年齡≥35歲兩組中，各個指標(biāo)水平在孕早期、孕中期、孕晚期水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在產(chǎn)次=1與產(chǎn)次≥2兩組中，各個指標(biāo)水平在孕早期、孕中期、孕晚期中的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在孕早期、孕中期、孕晚期中，F(xiàn)IB、D-Dimer、PLT、PT、APTT、TT水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.016)。FIB、D-Dimer的水平隨著孕周的遞增而增加(r=0.325、r=0.588，P<0.05)；PLT、PT、APTT、TT的水平隨著孕周的遞增而遞減(r=-0.51、r=-0.273、r=-0.296、r=-0.213，P<0.05)，見圖1。

2.3 健康非孕組與孕期各組凝血指標(biāo)的比較 健康非孕組的凝血指標(biāo)分別與孕早期、孕中期、孕晚期的凝血指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；健康非孕組的FIB、D-Dimer的均數(shù)小于各孕期FIB、D-Dimer的均數(shù)；健康非孕組的PLT、PT、APTT、TT的均數(shù)大于各孕期PLT、PT、APTT、TT的均數(shù)，見表1和圖1。

2.4 各孕期凝血指標(biāo)的參考區(qū)間 孕期FIB參考區(qū)間：孕早期為2.75～5.05 g/L，孕中期為3.18～5.08 g/L，孕晚期為3.11～6.03 g/L；孕期D-Dimer參考區(qū)間：孕早期為1.04 μg/mL，孕中期為2.06 μg/mL，孕晚期為2.49 μg/mL；孕期PLT參考區(qū)間：孕早期為134～315 mmol/L，孕中期為124～322 mmol/L，孕晚期為116～320 mmol/L；孕期PT參考區(qū)間：孕早期為11.60～14.60 s，孕中期為11.52～14.73 s，孕晚期為11.32～13.80 s；孕期APTT參考區(qū)間：孕早期為29.20～48.18 s，孕中期為29.04～46.48 s，孕晚期為28.50～39.04 s；孕期TT參考區(qū)間：孕早期為14.20～20.10 s，孕中期為13.62～18.68 s，孕晚期為13.42～18.57 s。見表2。

圖1 不同時期的血漿FIB、D-Dimer、PLT、PT、APTT、TT的水平

指標(biāo)孕早期孕中期孕晚期健康非孕組FIB(g/L)4.03±0.744.17±0.644.56±0.762.80±0.41D-Dimer(μg/mL)0.38±0.360.88±0.651.25±0.800.10±0.24PLT(×109·L-1)237±47231±49227±54240±31PT(s)12.99±1.1512.87±2.1912.35±0.6113.01±0.53APTT(s)35.36±4.5633.81±4.1732.91±1.6737.20±2.98TT(s)16.50±1.6715.95±1.1715.85±1.1817.48±1.06

表2 各孕期FIB、D-Dimer、PLT、PT、APTT、TT的參考區(qū)間

2.5 靜脈血栓栓塞組中D-Dimer水平 4例孕產(chǎn)婦于孕中期診斷為DVT，1例孕產(chǎn)婦于孕早期診斷為DVT，其D-Dimer的水平分別為2.7、9.1、65.5、12.9、10.73 μg/mL。3例孕產(chǎn)婦于孕晚期診斷為肺栓塞，其孕中期D-Dimer的水平分別是3.51、6.20、9.20 μg/mL，孕晚期分別是17.5、9.3、19.7 μg/mL。由以上數(shù)據(jù)可見，5例DVT及3例PE的產(chǎn)婦每次監(jiān)測的D-Dimer水平均高于本研究制定的相應(yīng)孕期的參考區(qū)間，全部為陽性結(jié)果。

2.6 產(chǎn)后出血妊娠晚期組D-Dimer水平 產(chǎn)后出血妊娠晚期組75例，D-Dimer均值4.93 μg/mL，P95：11.43 μg/mL。與孕晚期691例比較，產(chǎn)后出血組D-Dimer明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。產(chǎn)后出血妊娠晚期組75例中有3例孕婦的D-Dimer水平在本研究提供的孕晚期D-Dimer參考區(qū)間之內(nèi)。

2.7 D-Dimer水平對產(chǎn)后出血的預(yù)測價值 將產(chǎn)后出血組D-Dimer結(jié)果繪制成ROC曲線(圖2)，曲線面積為0.918，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.014，95%CI為0.89～0.94，最佳臨界值為2.65 μg/mL，此時特異度為80.0%，敏感度為89.5%，約登指數(shù)為0.695，見表3。

圖2 D-Dimer對預(yù)測產(chǎn)后出血的ROC曲線

臨界值敏感度(%)特異度(%)約登指數(shù)2.62 μg/mL89.579.20.6932.65 μg/mL89.580.00.6952.67 μg/mL88.281.20.6942.70 μg/mL86.882.10.689

3 討論

3.1 各孕期凝血指標(biāo)水平變化趨勢及參考區(qū)間的建立 妊娠期間孕婦凝血系統(tǒng)增強，抗凝及纖溶系統(tǒng)減弱，使得妊娠期處于高凝狀態(tài)[8]。妊娠期高凝狀態(tài)，導(dǎo)致妊娠期的凝血功能標(biāo)準(zhǔn)不能參照于非孕人群的參考范圍，否則將會產(chǎn)生很高的假陽性結(jié)果。因此，應(yīng)針對不同孕期應(yīng)建立相對應(yīng)的參考區(qū)間。許多學(xué)者對不同孕期的孕婦和健康非孕婦的凝血功能指標(biāo)進行了比較，由于研究對象和統(tǒng)計學(xué)方法不同，導(dǎo)致研究結(jié)果相差較大[9-10]。為避免個體差異對研究結(jié)果的影響，本研究采用縱向研究方法，對同一孕婦進行不同妊娠期的凝血功能檢查，可能比大多數(shù)研究者采用橫斷面研究更具有可信服力[11-13]。本研究將年齡及產(chǎn)次進行了亞組分析，進一步明確了年齡及產(chǎn)次對妊娠期凝血功能的影響，再者通過比較VTE孕婦的D-Dimer水平來評估參考區(qū)間的有效性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在孕早期、孕中期、孕晚期中，F(xiàn)IB、D-Dimer、PLT、PT、APTT、TT水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)IB、D-Dimer水平隨孕周遞增而升高，PLT、PT、APTT、TT的水平隨著孕周的遞增而縮短，并且孕早期FIB、D-Dimer水平均高于非孕組，孕早期PLT、PT、APTT、TT水平均小于非孕組。不同孕期組FIB、D-Dimer、PLT、PT、APTT、TT水平的組間比較, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.016)，因此需要建立各個孕期相對應(yīng)的參考區(qū)間。本研究分析得出的孕期血漿FIB、D-Dimer、PLT、PT、APTT、TT水平變化趨勢與大多數(shù)文獻報道的結(jié)果基本一致，然而參考區(qū)間上下限的具體數(shù)值各有千秋，如Gong等[6]通過橫斷面研究分析孕早期FIB、D-Dimer、PT、APTT、TT參考區(qū)間分別為：1.98～4.13 g/L，1.67 μg/mL，11.40～14.07 s，29.97～44.69 s，4.92～19.03 s；孕中期：2.63～5.19 g/L，2.81 μg/mL，9.98～12.84 s，28.53～40.70 s，13.51～19.82 s；孕晚期：2.80～5.56 g/L，27.08 μg/mL，9.48～12.58 s，28.61～40.80 s，14.10～19.61 s。與本研究相比，未分析PLT計數(shù)指標(biāo)，得出的參考區(qū)間并不是完全一致，但總體趨勢相同，這種差異可能與不同地域、不同測定方法有關(guān)。Reger等[14]根據(jù)胎齡分組，分為孕周16周、26周、36周，對83例孕產(chǎn)婦這3個時間點監(jiān)測FIB及D-Dimer，建立FIB及D-Dimer的參考區(qū)間分別為：FIB：2.77～6.09 g/L，3.35～6.93 g/L，4.18～8.13 g/L；D-Dimer：152～607 ng/mL，191～874 ng/mL，260～1 036 ng/mL。跟本研究結(jié)果相比，分組、數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法、人種均存在差異，導(dǎo)致FIB水平明顯升高，同時因D-Dimer監(jiān)測試劑不同，導(dǎo)致無法相比。因此在建立參考區(qū)間時，應(yīng)考慮地域、人種、試劑等不同因素。吳利等[15]和Wang等[16]將健康孕婦分為<20周、20～32周、>32周組，監(jiān)測D-Dimer指標(biāo)變化情況，與本研究相比，他們分析的D-Dimer的參考區(qū)間均偏高，可能是因納入的孕產(chǎn)婦例數(shù)偏少及分組存在差異，從而導(dǎo)致D-Dimer的上限值偏大。跟上述研究比較，本研究將年齡及產(chǎn)次進行了亞組分析，進一步明確了年齡及產(chǎn)次對妊娠期凝血功能的影響，再者采用縱向研究，避免因不同個體間的差異對研究結(jié)果產(chǎn)生的影響，更加準(zhǔn)確分析了不同妊娠期孕婦的凝血功能變化規(guī)律，最后通過比較VTE孕婦的D-Dimer水平來評估參考區(qū)間的有效性。綜上所述，本研究結(jié)果得出的凝血功能指標(biāo)的參考區(qū)間具有很強的實用性。本研究存在的不足是研究局限于單個醫(yī)療中心，未能代表所有的健康孕產(chǎn)婦，及未監(jiān)測產(chǎn)后凝血功能水平的情況。

3.2 D-Dimer參考區(qū)間在靜脈栓塞中的應(yīng)用 研究指出，妊娠婦女發(fā)生靜脈栓塞的風(fēng)險是同年齡非妊娠婦女的4～5倍，成為發(fā)達國家孕婦死亡最主要的原因。2015年RCOG指南[17]指出，妊娠期使用CTPA之后，胎兒在兒童時期患癌癥的概率有所升高。D-Dimer檢查相對于其他診斷方法來說是非侵入性，成本低，且對胎兒無傷害。D-Dimer作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進的標(biāo)志物，雖然D-Dimer檢測在排除未懷孕群體中的靜脈栓塞方面具有突出的作用，但是在妊娠期間呈階梯式的升高，可達正常的1～10倍，因此以D-Dimer<500.0 ng/mL來排除靜脈栓塞意義不大。制定孕產(chǎn)婦D-Dimer的疾病界定值是一項十分嚴謹、繁瑣與昂貴的工作，在取得大家公認的權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)之前，可以首先建立起孕產(chǎn)婦血漿D-Dimer的參考區(qū)間，即使不能對相關(guān)疾病做出最終診斷，至少可以為其陰性排除作用的發(fā)揮提供數(shù)據(jù)支持。Chan等[18]外國研究者納入228例疑似VTE的孕婦參加了8年的隨訪，通過影像學(xué)檢查其中15例診斷為DVT，通過繪制的ROC曲線，計算出的最佳陰性臨界值為1.89 μg/mL。本研究發(fā)現(xiàn)以各孕期D-Dimer參考區(qū)間為標(biāo)準(zhǔn)，8例靜脈栓塞的孕產(chǎn)婦的D-Dimer均為陽性值，但本研究VTE病例數(shù)有限,只能對參考區(qū)間的有效性進行驗證，無法建立適用于妊娠期婦女排除VTE的臨界值，有待完善一個大型的、長期的、多中心研究來建立排除VTE的臨界值。

3.3 孕晚期D-Dimer對產(chǎn)后出血的預(yù)測價值 產(chǎn)后出血是分娩時的嚴重并發(fā)癥，其發(fā)生率約為3%，是我國產(chǎn)婦死亡的首要原因[19]。產(chǎn)后出血病程發(fā)展快速，一旦合并凝血功能發(fā)生障礙，即可并發(fā)DIC，從而進一步加劇產(chǎn)后出血，兩者互為惡性循環(huán)。D-Dimer作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進的標(biāo)志物，Endo-Kawamura等[20]研究表明D-Dimer升高是產(chǎn)后出血的高危險因素。目前關(guān)于產(chǎn)后出血和D-Dimer的研究主要局限在產(chǎn)后出血發(fā)生后，產(chǎn)后出血引起繼發(fā)性纖溶亢進，D-Dimer濃度異常升高，但是對于孕晚期D-Dimer變化與產(chǎn)后出血相關(guān)性研究較少。本研究表明，產(chǎn)后出血妊娠晚期組與正常妊娠晚期比較，血漿D-Dimer水平明顯升高；D-Dimer含量為2.65 μg/mL作為預(yù)測產(chǎn)后出血的最佳臨界值，其特異度為80.0%，敏感度為89.5%，約登指數(shù)為0.695。通過對孕晚期血漿D-Dimer的定量測定，可盡早對患者的血栓前狀態(tài)和繼發(fā)性纖溶亢進作出及時評估，預(yù)測其并發(fā)產(chǎn)后出血的風(fēng)險，降低產(chǎn)后出血發(fā)生率，減少圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦的死亡。本研究納入產(chǎn)后出血例數(shù)有限，且影響D-Dimer的因素眾多，如合并妊娠期高血壓、糖尿病及肝炎等，因此在納入實驗對象時，需要進一步排除影響D-Dimer的水平的疾病。所以本研究的D-Dimer含量對產(chǎn)后出血的預(yù)測的臨界值只能作為參考，其準(zhǔn)確性有待進一步研究。

本研究采用縱向研究建立了妊娠各期凝血功能的參考區(qū)間，提高了其在孕產(chǎn)婦中的應(yīng)用價值。D-Dimer水平變化對VTE有一定的預(yù)警性，但是本研究病例有限，無法建立妊娠期排除VTE的臨界值，有待完善一個大樣本研究。D-Dimer升高是PPH的危險因素，影響D-Dimer的因素眾多，本研究的D-Dimer含量對PPH的預(yù)測的臨界值只能作為參考，其準(zhǔn)確性進一步研究。