單曉山,劉 宇,樓群兵,周振峰

單曉山,劉宇,樓群兵,義烏市中心醫(yī)院麻醉科 浙江省義烏市322000

周振峰,浙江省人民醫(yī)院麻醉科 浙江省杭州市 310014

核心提要: 七氟醚通過上調(diào)miR-34a的表達(dá)抑制人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,而轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor后逆轉(zhuǎn)了七氟醚對HCT116細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用,該過程可能與調(diào)控MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平有關(guān).

0 引言

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,在西方國家其發(fā)病率較高,是第三大常見癌癥[1].隨著社會(huì)環(huán)境、飲食習(xí)慣和生活方式的改變,我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率亦呈逐年上升的趨勢[2].結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)、浸潤和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[3],因此深入探究其發(fā)病和發(fā)展機(jī)制對結(jié)直腸癌的診斷、治療和預(yù)后具有重要意義.基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和MMP-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)均屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族,可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分參與腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移.七氟醚是臨床上常用的吸入性麻醉藥,廣泛應(yīng)用于多種腫瘤切除手術(shù)的麻醉誘導(dǎo)和維持[4].近期研究顯示,七氟醚對膠質(zhì)瘤、肺癌、骨肉瘤等腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡、遷移和侵襲具有抑制作用[5-7].目前關(guān)于七氟醚對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究尚無報(bào)道.微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度約為20 nt的非編碼RNA,在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲和遷移等過程中扮演重要角色.研究顯示,miR-34a在食管鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑制細(xì)胞遷移和侵襲的作用[8,9].有報(bào)道稱,過表達(dá)miR-34a能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[10].本研究以人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞為研究對象,觀察七氟醚對HCT116細(xì)胞遷移和侵襲的影響,及對miR-34a表達(dá)量的調(diào)控作用,并探討其作用的分子機(jī)制,以期為七氟醚應(yīng)用于結(jié)直腸癌的診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞庫);七氟醚(美國Baxter公司);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司);胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素(杭州四季青生物工程材料有限公司);Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為試劑有限公司);SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(日本TaKaRa公司);miR-34a inhibitor和陰性對照inhibitor control(廣州銳博生物科技有限公司);引物合成及測序均由上海生工生物工程有限公司完成;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司);CCK-8試劑(碧云天生物技術(shù)研究所);PVDF膜(美國Abcam公司);孔徑8 μm的Transwell小室(美國Corning公司);Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司);ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(美國Thermo Fisher公司);MMP-2抗體、MMP-9抗體、GAPDH抗體及二抗(美國CST公司).

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng): 人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含100 U/L青霉素、100 U/L鏈霉素)中,放置在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài),每隔1 d更換1次新鮮培養(yǎng)基.待細(xì)胞生長匯合度達(dá)80%以上時(shí),用胰蛋白酶消化細(xì)胞,進(jìn)行傳代培養(yǎng),取對數(shù)增殖期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.2 CCK-8檢測七氟醚對細(xì)胞增殖能力的影響: 將處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞接種到96孔板中,接種密度為1×104個(gè)/孔,將細(xì)胞隨機(jī)分為5組: 0%七氟醚組、1%七氟醚組、2%七氟醚組、4%七氟醚組、8%七氟醚組.將各組細(xì)胞培養(yǎng)板分批次放入無菌密閉的玻璃箱中,玻璃箱兩側(cè)壁分別安裝進(jìn)氣口和出氣口,進(jìn)氣口連接麻醉機(jī),出氣口連接麻醉氣體監(jiān)測儀.0%七氟醚組細(xì)胞通入95% O2-2.5% CO2混合氣體,其余各組在此基礎(chǔ)上分別通入1%、2%、4%、8%七氟醚,5組細(xì)胞處理2、4、6 h時(shí)采用CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力,即在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別加入10 μL CCK-8溶液,于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h,使用酶標(biāo)儀測定每孔細(xì)胞在450 nm處光密度值(OD值).計(jì)算各組細(xì)胞增殖率,(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD)/(對照組OD值-空白孔OD)×100%.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值.

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組: 轉(zhuǎn)染前1 d將HCT116細(xì)胞接種到6孔板中,接種密度為2×105個(gè)/孔,放置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞生長密度達(dá)40%-50%時(shí),分別將miR-34a inhibitor和inhibitor control轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞,將轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor的細(xì)胞記為anti-miR-34a組,將轉(zhuǎn)染inhibitor control的細(xì)胞記為anti-NC組,未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞記為Control組.轉(zhuǎn)染操作步驟嚴(yán)格參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,給予4%七氟醚處理4 h(根據(jù)七氟醚對細(xì)胞增殖影響及qRT-PCR檢測實(shí)驗(yàn),篩選出的七氟醚作用濃度和時(shí)間),分別記為Sevoflurane組、Sevoflurane+anti-NC組和Sevoflurane+anti-miR-34a組.

1.2.4 qRT-PCR檢測miR-34a表達(dá)水平: 分別收集Control組、anti-NC組和anti-miR-34a組轉(zhuǎn)染24 h的HCT116細(xì)胞,以及4%七氟醚處理2、4、6 h的HCT116細(xì)胞,采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA,使用Nanodrop超微量核酸蛋白檢測儀測定所提RNA的濃度和純度.參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,以cDNA為模板,使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒,以U6為內(nèi)參,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,采用20 μL反應(yīng)體系,其中模板0.8 μL,上下游引物各1 μL,2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL,剩余以ddH2O補(bǔ)足20 μL.反應(yīng)條件為: 94 ℃ 預(yù)變性5 min,94 ℃ 變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,采用40個(gè)循環(huán).反應(yīng)結(jié)束后分析U6和miR-34a閾值(Ct值),以2-ΔΔCt法計(jì)算各組HCT116細(xì)胞miR-34a相對表達(dá)水平.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值.miR-34a引物: F-5'-CCCACTCACCGTACTAA-3';R-5'-GTGGTTTCAAGGCCAGATGT-3';U6引物: F-5'-AAACCGTTACCATTACTGAGTT-3';R-5'-CGCT TCGGCAGCACATATAC-3'.

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力: 取50 μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室,于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置30 min備用.收集Control組、Sevoflurane組、Sevoflurane+anti-NC組和Sevoflurane+anti-miR-34a組HCT116細(xì)胞,用不含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL.取200 μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室,下室加入600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液,放置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h.取出小室,除去上室培養(yǎng)液,以無水甲醇固定30 min.使用棉簽輕輕拭去上室殘留細(xì)胞,以0.1%結(jié)晶紫染色20 min,吸去染色液,在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野,觀察計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù).實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值,以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力.同樣的方法檢測細(xì)胞遷移能力,除Transwell小室的上室未用Matrigel基質(zhì)膠包被外,其余步驟均與侵襲實(shí)驗(yàn)相同.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值.

1.2.6 Western blot檢測各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平: 收集各組待測HCT116細(xì)胞,使用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞中總蛋白,采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒對蛋白進(jìn)行定量測定.使用上樣緩沖液與蛋白樣品混合,在沸水浴中加熱變性.采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(10%分離膠和5%濃縮膠)進(jìn)行電泳,取50 μg蛋白樣品加到上樣孔,電泳分離蛋白.電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,在5%脫脂奶粉中封閉2 h.分別加入1:500稀釋的MMP-2一抗、1:500稀釋的MMP-9一抗,4 ℃過夜孵育.再加入1:2000稀釋的二抗,室溫孵育2 h.加入ECL顯色液,顯影、定影,以凝膠成像儀拍照,以GAPDH為內(nèi)參,采用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值,以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值.

表1 不同濃度的七氟醚對HCT116細(xì)胞增殖率的影響(mean±SD)

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)計(jì)量數(shù)據(jù)均采用mean±SD表示,多組間差異比較采用單因素方差分析,組間差異比較采用SNK-q檢驗(yàn)分析,其中以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 七氟醚對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響 分別以0%、1%、2%、4%、8%的七氟醚處理結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞2、4、6 h,以CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力,結(jié)果如表1所示,隨著七氟醚濃度的升高HCT116細(xì)胞的增殖率逐漸降低.4%和8%七氟醚組細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)增殖能力均受到明顯抑制(P＜0.05);2%七氟醚組細(xì)胞從4 h開始增殖能力受到明顯抑制(P＜0.05);1%七氟醚組細(xì)胞增殖能力無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05).結(jié)果說明七氟醚能夠抑制直腸癌HCT116細(xì)胞增殖.根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn),后續(xù)選擇4%七氟醚進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.2 七氟醚上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-34a的表達(dá) 以4%七氟醚處理直腸癌HCT116細(xì)胞,采用qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平,結(jié)果如圖1所示,與0 h組比,處理4、6 h時(shí)HCT116細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05),而處理2 h時(shí)HCT116細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05).提示七氟醚能夠促進(jìn)HCT116細(xì)胞中miR-34a的表達(dá).根據(jù)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用4%七氟醚處理4 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.3 檢測miR-34a inhibitor轉(zhuǎn)染效率 與Control組比,anti-NC組HCT116細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05),anti-miR-34a組HCT116細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05).見圖2.說明在HCT116細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor成功下調(diào)了miR-34a的表達(dá).

圖1 4%七氟醚處理直腸癌HCT116細(xì)胞對miR-34a表達(dá)的影響.aP＜0.05,與0 h組比.

圖2 各組HCT116細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平比較.aP＜0.05,與對照組組比;cP＜0.05,與anti-NC組相比.

2.4 抑制miR-34a對七氟醚調(diào)節(jié)HCT116細(xì)胞遷移和侵襲的影響 成功下調(diào)HCT116細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)后,給予4%七氟醚處理4 h,Transwell實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示(圖3),與Control組比,Sevoflurane組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.05).與Sevoflurane組比,Sevoflurane+anti-NC組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)無明顯改變(P＞0.05);而Sevoflurane+antimiR-34a組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多(P＜0.05).以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明七氟醚能夠抑制HCT116細(xì)胞遷移和侵襲,而anti-miR-34a能夠逆轉(zhuǎn)七氟醚抑制HCT116細(xì)胞遷移和侵襲的作用.

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力.A: Transwell實(shí)驗(yàn)檢測HCT116細(xì)胞遷移能力;B: Transwell實(shí)驗(yàn)檢測HCT116細(xì)胞侵襲能力;C:各組HCT116細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較.aP＜0.05,與對照組比;cP＜0.05,與Sevoflurane組比.

2.5 抑制miR-34a對七氟醚調(diào)節(jié)HCT116細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot檢測結(jié)果如圖4,與Control組比,Sevoflurane組HCT116細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.05).與Sevoflurane組比,Sevoflurane+anti-NC組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平無明顯改變(P＞0.05),而Sevoflurane+anti-miR-34a組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05).表明七氟醚能夠抑制HCT116細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá),而anti-miR-34a可回調(diào)七氟醚對MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)抑制的作用.

3 討論

結(jié)直腸癌是全球范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,具有較高的發(fā)病率和致死率,目前已成為世界公共衛(wèi)生問題之一[11].近年來結(jié)直腸癌的診治水平得到一定的改善,但結(jié)直腸癌患者術(shù)后多出現(xiàn)復(fù)發(fā),總體預(yù)后仍不能達(dá)到理想水平.多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致該情況的主要原因.近期研究發(fā)現(xiàn),術(shù)中使用的麻醉藥對多數(shù)腫瘤患者的生存率產(chǎn)生一定的影響[12].七氟醚是腫瘤切除手術(shù)中常用的吸入性麻醉藥,臨床及基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),七氟醚對腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移均具有一定程度的影響[13,14].Liang等[15]人研究發(fā)現(xiàn),七氟醚能夠通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α抑制缺氧誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移.黎真真等人以1%的七氟醚干預(yù)卵巢癌SKOV3細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SKOV3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力均明顯受到抑制,該過程與阻礙上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程及減輕干細(xì)胞特性有關(guān)[16].目前關(guān)于七氟醚對結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的研究鮮有報(bào)道.因此本實(shí)驗(yàn)以不同濃度的七氟醚干預(yù)人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞不同時(shí)間,觀察其對HCT116細(xì)胞增殖的影響,篩選出其作用濃度為4%,用于后續(xù)探究對HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響.

圖4 Western blot檢測各組HCT116細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平.A: Western blot檢測各組HCT116細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平;B: 各組HCT116細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平比較.aP＜0.05,與對照組比;cP＜0.05,與Sevoflurane組比.

目前關(guān)于miRNA參與腫瘤的發(fā)病和進(jìn)展引起眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注[17,18].據(jù)報(bào)道,miR-34a在調(diào)控皮膚鱗狀細(xì)胞癌、食管癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中扮演重要角色[19-21].Luo等[22]研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA GAPLINC通過調(diào)節(jié)miR-34a/c-MET信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移和侵襲.Chandrasekaran等[23]發(fā)現(xiàn)miR-34a通過下調(diào)高遷移率族蛋白盒1(HMGB1)的表達(dá)抑制人宮頸癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲.說明miR-34a能夠調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),4%的七氟醚處理HCT116細(xì)胞4 h后,miR-34a的表達(dá)水平顯著升高.提示七氟醚可能通過上調(diào)miR-34a的表達(dá)調(diào)控結(jié)直腸癌的遷移和侵襲.為進(jìn)一步驗(yàn)證該猜想,本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor下調(diào)HCT116細(xì)胞中miR-34a的表達(dá),并以4%的七氟醚處理HCT116細(xì)胞4 h,經(jīng)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn),七氟醚能夠抑制HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力,而下調(diào)miR-34a的表達(dá)聯(lián)合七氟醚處理的細(xì)胞能夠逆轉(zhuǎn)七氟醚對HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用.以上結(jié)果提示miR-34a參與了七氟醚抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的過程.此外,本實(shí)驗(yàn)檢測了基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)七氟醚能夠抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá),而下調(diào)miR-34a可恢復(fù)七氟醚對MMP-2和MMP-9表達(dá)下調(diào)的作用.MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白水解酶家族中重要成員,它們能夠通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜等物質(zhì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移,在腫瘤浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[24,25].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,七氟醚通過上調(diào)miR-34a的表達(dá),抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,且該過程與下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)病率和致死率均處較高水平.結(jié)直腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致預(yù)后不良的主要原因.七氟醚是腫瘤切除手術(shù)中常用麻醉藥,多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),七氟醚能夠抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移.然而其具體作用機(jī)制目前尚不十分明確.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本實(shí)驗(yàn)探究七氟醚對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響,并初步探討其作用機(jī)制,以期為臨床上使用七氟醚治療結(jié)直腸提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本實(shí)驗(yàn)探討七氟醚對結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響主要通過調(diào)控miR-34a的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,且該過程與MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平的變化有關(guān).本研究為進(jìn)一步探究七氟醚對腫瘤侵襲和遷移的機(jī)制研究奠定一定的理論基礎(chǔ).

實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)主要通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測七氟醚對HCT116細(xì)胞中miR-34a表達(dá)的影響,CCK-8法檢測七氟醚對細(xì)胞增殖能力的影響;通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)抑制細(xì)胞中miR-34a的表達(dá);通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測對細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響;Western blot檢測對細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,七氟醚能夠抑制結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,且上調(diào)miR-34a的表達(dá).在此基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor抑制miR-34a的表達(dá)后,七氟醚對細(xì)胞侵襲和遷移能力的抑制作用部分被逆轉(zhuǎn),此外發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平發(fā)生變化.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

七氟醚能夠抑制結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞侵襲和遷移,其作用機(jī)制與上調(diào)miR-34a的表達(dá),抑制MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān),為七氟醚對腫瘤侵襲和遷移的影響的分子機(jī)制探究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

展望前景

本實(shí)驗(yàn)以不同濃度的七氟醚干預(yù)人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞不同時(shí)間,觀察其對HCT116細(xì)胞增殖的影響,篩選出其作用濃度為4%,用于后續(xù)探究對HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響.