貢莎莎，孟慶玲，*，喬 軍，鐘文強(qiáng)，黃運(yùn)福，張國武，陳 英，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

捕食線蟲真菌(Nematophagousfung)一般分為捕食菌物、內(nèi)寄生菌物、機(jī)會(huì)菌物和產(chǎn)毒素菌物，能捕捉、寄生、定植和產(chǎn)生毒素，殺死線蟲，涉及到真菌界的壺菌門、接合菌門、子囊菌門、擔(dān)子菌門、有絲分裂菌類和假菌界的卵菌門[1-2]，種類繁多，在生物防控線蟲方面擁有巨大的價(jià)值和潛力。

少孢節(jié)叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)是一種典型的捕食線蟲真菌，能夠產(chǎn)生黏性菌網(wǎng)捕捉線蟲。在侵染線蟲過程中，少孢節(jié)叢孢菌可分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和膠原酶等胞外水解酶，與捕食結(jié)構(gòu)共同作用從而高效地完成線蟲的固定、角質(zhì)層的入侵以及宿主細(xì)胞的降解等過程[3-6]。2011年，Yang等[3]對(duì)經(jīng)線蟲誘導(dǎo)產(chǎn)生捕食器官的少孢節(jié)叢孢菌進(jìn)行基因組學(xué)分析，預(yù)測(cè)出16個(gè)具有糖苷水解酶18家族幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)特征的幾丁質(zhì)酶基因[4]，發(fā)現(xiàn)這些幾丁質(zhì)酶在碳源缺乏或幾丁質(zhì)底物存在時(shí)表達(dá)量明顯上調(diào)，提示幾丁質(zhì)酶在少孢節(jié)叢孢菌捕食線蟲的過程中可能發(fā)揮重要作用。然而，目前對(duì)少孢節(jié)叢孢菌的幾丁質(zhì)酶生物學(xué)功能及其作用機(jī)制尚不清楚。

本研究對(duì)少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株幾丁質(zhì)酶AO-483基因進(jìn)行克隆和分子特征分析，構(gòu)建原核表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)重組融合蛋白；采用DNS還原糖法檢測(cè)通過Ni-NAT親和層析柱純化的重組幾丁質(zhì)酶活性，并將其作用于秀麗隱桿線蟲Ⅰ期和Ⅳ期幼蟲以驗(yàn)證其生物學(xué)活性，為進(jìn)一步揭示幾丁質(zhì)酶AO-483在少孢節(jié)叢孢菌捕食線蟲過程中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑及培養(yǎng)基

少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株(ArthrobotrysoligosporaXJ-A1)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α菌株、大腸埃希菌BL21菌株(DE3)和pET32a(+)質(zhì)粒由石河子大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T載體、His融合蛋白純化柱購自日本TaKaRa公司；EZ柱式真菌RNA抽提試劑盒購自上海生物工程有限公司；透析袋購自廣州東盛生物科技有限公司；鼠抗His抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司；DNS試劑購自北京生東科技有限公司；幾丁質(zhì)購自上海瑞永生物科技有限公司；NGM培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[7]配制。

1.2 幾丁質(zhì)酶基因AO-483cDNA的克隆及序列分析

按照RNA提取試劑盒說明書提取少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1分離株RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。引物由Primer 5設(shè)計(jì)，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。上游引物F: 5′-CCGGAATTCATGCCGCCAGTCCTCCC-3′；下游引物R: 5′-CGAGCGGCCGCTTATTCCTGGGCCTCTAAGCC-3′(下劃線部分分別為EcoRI和NotI酶切位點(diǎn))。反應(yīng)體系：PCR Mixture 8 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，補(bǔ)足超純水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，63 ℃ 40 s，72 ℃ 70 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，回收后與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒pT-AO483進(jìn)行測(cè)序。利用在線生物分析軟件對(duì)AO-483基因及其編碼蛋白進(jìn)行序列分析。

1.3 原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-A0483的構(gòu)建

用EcoRI和NotI分別對(duì)pMD19-AO483和pET32a(+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收pET32a載體片段和AO-483目的片段，在T4 DNA 連接酶作用下16 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選和菌液PCR驗(yàn)證后獲得重組質(zhì)粒pET-A0483。

1.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE和Western blot鑒定

將重組質(zhì)粒pET-AO483轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，取陽性克隆菌液200 μL接種于200 mL含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，37 ℃，180 r·min-1過夜培養(yǎng)至D600為0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol·L-1的誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，6 h后收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析，并以小鼠抗少孢節(jié)叢孢菌多克隆血清抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot鑒定。

1.5 重組幾丁質(zhì)酶AO-483的純化

將收集的菌體用細(xì)胞裂解液懸浮后反復(fù)凍融，離心收集沉淀，加10 mL 8 mol·L-1尿素后，于室溫放置2 h，用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化，然后將純化蛋白AO-483轉(zhuǎn)移至透析袋中，分別在6、4、2、1 mol·L-1尿素及去離子水中透析6～8 h，然后用蔗糖濃縮3 h后，收集透析袋中蛋白。

1.6 重組幾丁質(zhì)酶AO-483酶活性測(cè)定

1.6.1 N-乙酞葡萄糖胺(NAG)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制濃度為1 mg·mL-1的NAG標(biāo)準(zhǔn)液，準(zhǔn)確取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL分別加入到10 mL的試管中，并分別補(bǔ)加超純水至2 mL后加入3 mL DNS試劑。以NAG濃度為橫坐標(biāo)、不同濃度的NAG反應(yīng)液(3個(gè)重復(fù))在540 nm處吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 重組幾丁質(zhì)酶AO-483活性測(cè)定

采用DNS(二硝基水楊酸)法測(cè)還原糖含量來測(cè)定重組酶活性，參照文獻(xiàn)[8]制備膠體幾丁質(zhì)，參考文獻(xiàn)[9]以膠體幾丁質(zhì)為底物測(cè)定酶活性。取200 μL粗酶液和200 μL膠體幾丁質(zhì)混勻，37 ℃反應(yīng)30 min后加入600 μL DNS試劑反應(yīng)，取上清200 μL于540 nm處測(cè)D值。在此反應(yīng)體系下每生成1 μg NAG所需的酶量定義為1個(gè)幾丁質(zhì)酶活力單位。

1.6.3 重組幾丁質(zhì)酶AO-483作用于秀麗隱桿線蟲幼蟲

將制備的秀麗隱桿線蟲Ⅰ期及Ⅳ期幼蟲懸液[7]分別與等量的重組幾丁質(zhì)酶AO-483混勻，對(duì)照組將幼蟲懸液分別與等量的PBS緩沖液混勻，置于37 ℃，作用0、0.5、1、6、12、24、36 h時(shí)分別取400 μL，利用 DNS試劑測(cè)定NAG含量，并通過顯微鏡觀察重組酶作用于幼蟲后其形態(tài)學(xué)變化，分析重組蛋白酶的生物學(xué)活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 少孢節(jié)叢孢菌AO-483基因的RT-PCR擴(kuò)增與克隆

利用特異性引物通過RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的基因AO-483大小為930 bp，與GenBank已公布的少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 24927)AO-483 cDNA大小一致(圖1)。

2.2 少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-483基因及編碼蛋白分析

序列分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，AO-483基因全長930 bp，編碼309個(gè)氨基酸，與少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 24927)幾丁質(zhì)酶AO-483基因序列同源性為96.88%，氨基酸序列同源性為97.73%。AO-483基因編碼蛋白具有1個(gè)Glyco-hydro-18結(jié)構(gòu)域(位于20～297位氨基酸)；催化活性區(qū)域位于17～281位，其特征序列為第96～100位的GMLGG為底物結(jié)合位點(diǎn)，第132～140位的LDGLDLDVE為水解酶催化活性位點(diǎn)。此外，還有5個(gè)CKⅡ磷酸化位點(diǎn)(位于66～69、107～110、185～188、213～216、253～256位氨基酸)，4個(gè)N端 ?；稽c(diǎn)(位于96～101、209～214、239～244、266～271位氨基酸)，1個(gè)PCK磷酸化位點(diǎn)(位于113～115位氨基酸)。SWISS-MODEL分析顯示(圖3)，幾丁質(zhì)酶AO-483具有典型的GH18幾丁質(zhì)酶三磷酸異構(gòu)酶桶形結(jié)構(gòu)域。

M，DL2000 DNA marker；1～3，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M，DL2000 DNA marker；1-3，Amplification products of RT-PCR.圖1 AO-483基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR product of AO-483 gene

2.3 重組質(zhì)粒pET-AO483的雙酶切鑒定結(jié)果

用EcoR I和NotI對(duì)重組質(zhì)粒pET-AO483進(jìn)行雙酶切，獲得5 874 bp和930 bp大小的2條核酸條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖4)，證實(shí)重組質(zhì)粒pET-AO483構(gòu)建成功。

2.4 重組蛋白SDS-PAGE和Western blot分析

如圖5所示，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析后，在相對(duì)分子質(zhì)量約52 ku處可見特異性反應(yīng)條帶，分子量與預(yù)期值相同；用鎳柱純化的蛋白酶出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的單一蛋白條帶。Western blot分析表明，表達(dá)的重組蛋白能與小鼠抗少孢節(jié)叢孢菌多克隆血清抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。

2.5 重組幾丁質(zhì)酶AO-483酶活性研究

根據(jù)NAG標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，以膠體幾丁質(zhì)為底物，檢測(cè)重組幾丁質(zhì)酶AO-483活性為223.31 U·mL-1。將重組幾丁質(zhì)酶液分別作用于Ⅰ期幼蟲和Ⅳ期幼蟲，利用DNS試劑測(cè)定該反應(yīng)過程中能否產(chǎn)生及能產(chǎn)生多少還原糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組未檢測(cè)到還原糖產(chǎn)生，而試驗(yàn)組作用于Ⅰ期幼蟲6 h后，在反應(yīng)液中檢測(cè)到還原糖產(chǎn)生，隨著反應(yīng)時(shí)間的增長，產(chǎn)生的還原糖量越多，分別為154.08、188.69、189.46、191.77 μg。作用于Ⅳ期幼蟲12 h后，才能檢測(cè)到還原糖產(chǎn)生，還原糖量也隨著反應(yīng)時(shí)間的增長而增多，分別為151.00、165.62、181.77 μg。

2.6 重組幾丁質(zhì)酶AO-483對(duì)秀麗隱桿線蟲幼蟲的降解作用

重組幾丁質(zhì)酶液作用Ⅰ期和Ⅳ期幼蟲后，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組Ⅰ期幼蟲在6 h時(shí)全部死亡，蟲體體壁皺縮破裂，至12 h時(shí)體壁組織發(fā)生降解，36 h時(shí)大部分體壁組織發(fā)生降解；對(duì)照組Ⅰ期幼蟲初期未見異常，蟲體繼續(xù)發(fā)育，后期蟲體活力下降，運(yùn)動(dòng)緩慢，但體壁完整(圖6)。與Ⅰ期幼蟲的對(duì)照組幼蟲類似，試驗(yàn)組Ⅳ期幼蟲在6 h時(shí)表現(xiàn)為活力下降，運(yùn)動(dòng)緩慢，至12 h時(shí)全部死亡，蟲體體壁部分發(fā)生降解，至36 h時(shí)大部分體壁組織發(fā)生降解；對(duì)照組Ⅳ期幼蟲初期未見異常，蟲體繼續(xù)發(fā)育，后期蟲體僵直，活力下降，但體壁完整(圖7)。

圖2 AO-483基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域模式圖Fig.2 Domains of AO-483 gene encoding protein

圖3 AO-483基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of tertiary structure of AO-483 gene encoded protein

M，DL 5 000 DNA marker；1，雙酶切pET-AO483重組質(zhì)粒；2，pET-AO483重組質(zhì)粒。M，DL 2 000 DNA marker；1，Double enzyme digestion for identification of recombinant of pET-AO483；2，Recombinant of pET-AO483.圖4 重組質(zhì)粒 pET-A0483雙酶切鑒定Fig.4 Restriction enzyme analysis of the recombinant plasmid pET-AO483

M，融合蛋白表達(dá)量； 1，pET32a空載體SDS-PAGE分析結(jié)果；2～4，重組載體pET-AO483誘導(dǎo)6 h SDS-PAGE分析結(jié)果；5，純化的重組酶AO-483 SDS-PAGE分析結(jié)果；6，未純化的重組酶AO-483 Western blot分析結(jié)果；7，純化的重組酶AO-483 Western blot分析結(jié)果。M，Expression of fusion protein；1，SDS-PAGE analysis results of pET32a no load induced protein expression；2-4，SDS-PAGE analysis results of expression of pET-AO483 recombinant was induced for 6 h；5，SDS-PAGE analysis results of purified recombinant enzyme AO-483；6，Western blot analysis results of unpurified recombinant enzyme AO-483；7，Western blot analysis results of purified recombinant enzyme AO-483.圖5 重組蛋白AO-483 SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant protein AO-483

3 討論

已有研究表明，作為線蟲的自然天敵，捕食線蟲性真菌分泌的胞外水解酶絲氨酸蛋白酶和幾丁質(zhì)酶在其捕食線蟲過程中可能發(fā)揮著降解蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)的重要作用。目前，已經(jīng)從捕食線蟲性真菌少孢節(jié)叢孢菌中分離鑒定的絲氨酸蛋白酶如PⅡ、Aoz1、P186等[10-11]，并且對(duì)其理化性質(zhì)、作用底物及降解線蟲活性開展了研究，證實(shí)了在捕食線蟲的過程中絲氨酸蛋白酶對(duì)角質(zhì)層的侵入、宿主細(xì)胞的降解有重要的生物學(xué)作用。然而，目前對(duì)于捕食線蟲性真菌幾丁質(zhì)酶的研究還較少。已有研究發(fā)現(xiàn)，通過基因組序列分析鑒定少孢節(jié)叢孢菌中有16個(gè)幾丁質(zhì)酶(AO-379、AO-406、AO-486、AO-492、AO-576、AO-587、AO-190、AO-483、AO-59、AO-342、AO-427、AO-31、AO-14、AO-223、AO-229和AO-801)，但其結(jié)構(gòu)與功能尚不清楚[4]。

幾丁質(zhì)酶廣泛存在于微生物、植物、動(dòng)物中，典型的GH18幾丁質(zhì)酶家族一般都含有信號(hào)肽、幾丁質(zhì)酶催化域、幾丁質(zhì)結(jié)合域及1個(gè)短的C端區(qū)域結(jié)構(gòu)，部分幾丁質(zhì)酶還含有幾丁質(zhì)酶插入結(jié)構(gòu)域[12-19]。本研究通過對(duì)具有強(qiáng)捕食活性的少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ-A1的幾丁質(zhì)酶AO-483基因進(jìn)行分子特征分析發(fā)現(xiàn)，AO-483屬于糖苷水解酶18家族，其含有幾丁質(zhì)底物結(jié)合位點(diǎn)GMLGG和幾丁質(zhì)酶催化活性位點(diǎn)LDGLDLDVE，與其他典型的GH18幾丁質(zhì)酶不完全相同。

圖6 重組幾丁質(zhì)酶AO-483作用秀麗隱桿線蟲Ⅰ期幼蟲后蟲體形態(tài)學(xué)觀察Fig.6 Morphological observation of Caenorhabditis elegans larvae stage 1 treated by recombinant AO-483

圖7 重組幾丁質(zhì)酶AO-483作用秀麗隱桿線蟲Ⅳ期幼蟲后蟲體形態(tài)學(xué)觀察Fig.7 Morphological observation of Caenorhabditis elegans larvae stage 4 treated by recombinant AO-483

幾丁質(zhì)是線蟲的體壁和蟲卵外殼的重要組成成分，能發(fā)揮屏障保護(hù)作用，使蟲卵及線蟲抵御外界不良環(huán)境。Waller等[20]認(rèn)為，捕食線蟲性真菌對(duì)Ⅲ期幼蟲的捕獲能力更強(qiáng)；Grant等[21]認(rèn)為，捕食線蟲性真菌分泌的GH18幾丁質(zhì)酶能夠降解根結(jié)線蟲Ⅰ期幼蟲的角質(zhì)層從而抑制其生長。本研究中，將重組AO-483酶液作用于秀麗隱桿線蟲幼蟲，利用DNS試劑在反應(yīng)6 h的Ⅰ期幼蟲反應(yīng)液以及反應(yīng)12 h的Ⅳ期幼蟲反應(yīng)液中檢測(cè)到還原糖產(chǎn)生，表明重組酶AO-483對(duì)于線蟲的幾丁質(zhì)成分具有降解作用。同時(shí)，通過對(duì)Ⅰ期幼蟲以及Ⅳ期幼蟲的形態(tài)學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)，重組酶對(duì)Ⅰ期幼蟲降解能力強(qiáng)于Ⅳ期幼蟲。本研究結(jié)果提示，少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-483在降解線蟲過程中發(fā)揮了重要的作用，為進(jìn)一步研發(fā)動(dòng)物消化道線蟲病新型生物防控制劑提供了科學(xué)依據(jù)。