王偉科，宋吉玲，巫優(yōu)良，閆 靜，陸 娜，袁衛(wèi)東，陳觀平

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310024； 2.江山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，浙江 江山 324104； 3.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江 杭州 310012)

桑黃是一種珍貴的藥用真菌，因寄生于桑樹樹干，子實(shí)體呈黃褐色而得名，俗稱桑耳、桑臣等，是我國一種傳統(tǒng)而名貴的中藥材[1]。桑黃真菌種群隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)[2]。桑黃的功效最早記載在《本草綱目》一書中，《藥性論》也有桑黃味微苦、性寒等功效描述[3]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為桑黃具利五臟、軟堅(jiān)、排毒、止血和止瀉等藥效，可用于治療痢疾、盜汗、血崩、血淋、脫肛和閉經(jīng)等癥[4]；現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，桑黃還具有抗腫瘤、降血糖、護(hù)肝、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等藥理作用[5-6]。因此，桑黃具有極高的開發(fā)利用價(jià)值。

當(dāng)前，桑黃產(chǎn)品的開發(fā)主要以桑黃子實(shí)體為原料，但由于桑黃野生資源的日益匱乏，加之桑黃子實(shí)體生長對環(huán)境的依賴性很高，生長周期長，產(chǎn)量不穩(wěn)定；對桑黃人工栽培等相關(guān)技術(shù)研究尚處于起步階段[7]，這嚴(yán)重限制了桑黃的進(jìn)一步開發(fā)和利用。而桑黃種質(zhì)鑒定、新品種選育及高效栽培技術(shù)研究等一直是研究者關(guān)注的重點(diǎn)。作為珍貴的藥用真菌，桑黃真菌大多寄生在桑樹、櫟樹、樺樹、楊樹等闊葉植物的枯立木及樹干上，且該類真菌的子實(shí)體均呈蹄形，同時(shí)與桑黃真菌在外觀形態(tài)上相似的大型真菌種類繁多，僅依賴于形態(tài)特征的傳統(tǒng)鑒定方法很難確定菌株的分類歸屬[8-10]。在基礎(chǔ)研究及開發(fā)應(yīng)用中，往往出現(xiàn)“同種異名”“同名異種”的現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙了桑黃新品種的選育及產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)是真菌核糖體RNA基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)的一部分，其在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，表現(xiàn)為種內(nèi)菌株間相對保守，種間差異比較明顯。這種特點(diǎn)使ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。即使親緣關(guān)系非常接近的2個(gè)種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異，顯示最近的進(jìn)化特征。因此，ITS已被廣泛應(yīng)用于微生物菌種分類與鑒定、中藥材鑒定和品質(zhì)評價(jià)、植物種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性與親緣關(guān)系、病原診斷、系統(tǒng)發(fā)育等不同方面的研究[11-14]。對種屬模糊的食用真菌ITS序列進(jìn)行測序，可通過將測序得到的ITS序列與已知真菌ITS序列比較，從而能獲得該菌株的信息及系統(tǒng)的遺傳譜系。由于用于真菌鑒定的ITS序列通常包括ITS1、5.8S和ITS2，長度為500～750 bp，故利用高保真PCR技術(shù)并結(jié)合直接測序法在食用真菌的分類、鑒定中有很大的優(yōu)越性[15]。

我們在參考真菌rDNA ITS擴(kuò)增通用引物及GenBank中登錄的桑黃真菌屬(Phellinusbaumii)rDNA ITS序列基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并合成了桑黃rDNA ITS通用引物，并利用PCR技術(shù)克隆了rDNA ITS基因片段，同時(shí)結(jié)合直接測序技術(shù)，對從杭州千島湖、桐廬等地區(qū)采集到的桑黃真菌進(jìn)行了分子鑒定及遺傳結(jié)構(gòu)分析工作。本文的研究結(jié)果可以提供一種準(zhǔn)確可靠且簡單易行的桑黃真菌分子鑒定技術(shù)，有助于明確各桑黃菌株的種屬來源及遺傳結(jié)構(gòu)，為桑黃真菌的分類及進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

測試菌種(株)收集自我國各主要桑黃真菌保藏單位(表1)。此外，檢索近期發(fā)表的GenBank中登錄的其他12種桑黃真菌ITS序列(基因登錄號分別為：AF080458.1、AF082102.1、AF200226.1、AF534065.1、AY436626.1、AY513234.1、AY640937.1、DQ103884.1、DQ462333.1、EF506943.1、EF694971.1、FJ940908.1)，下載保存，用于序列比較。

1.1.2 儀器與試劑

主要儀器：Veriti型PCR儀(ABI，USA)、DYY-6D電泳儀(北京六一儀器廠，中國)、GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)、3700型DNA測序儀(美國)。

表1桑黃真菌測試菌株來源

Table1The strains used for Sanghuang genetic diversity and molecular identification

序號No.菌株Strain菌株來源Source of strain序號No.菌株Strain菌株來源Source of strain1S1淳安微生物研究所Chunan Institute of Microbiology12S13淳安桑都食用菌專業(yè)合作社Chunan “sangdu” Edible Mushroom Professional Cooperative2S2淳安微生物研究所Chunan Institute of Microbiology13S15杭州市食用菌協(xié)會Hangzhou Edible Fungi Association3S3四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院Sichuan Academy of Agricultural Sciences14S17杭州市食用菌協(xié)會Hangzhou Edible Fungi Association4S4四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院Sichuan Academy of Agricultural Sciences15S19安徽金寨采集Collection from Jinzhai Anhui5S5浙江桐廬野生采集Wild collection from Tonglu Zhejiang16S21浙江淳安野生采集Wild collection from Chunan Zhejiang6S6浙江桐廬野生采集Wild collection from Tonglu Zhejiang17S22浙江淳安野生采集Wild collection from Chunan Zhejiang7S7浙江臨安野生采集Wild collection from Linan Zhejiang 18S23浙江淳安野生采集Wild collection from Chunan Zhejiang8S8浙江淳安野生采集Wild collection from Chunan Zhejiang19S26浙江衢州野生采集Wild collection from Quzhou Zhejiang9S9桐廬桐君堂藥業(yè)有限公司Tonglu Tong Jun Tang Pharmaceutical Co. Ltd.20S27安徽金寨采集Collection from Jinzhai Anhui10S10浙江桐廬野生采集Wild collection from Tonglu Zhejiang21S28浙江麗水采集Wild collection from Lishui Zhejiang11S11延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院Yanbian Agricultural Science Institute22SKHCH浙江開化采集Wild collection from Kaihua Zhejiang

主要試劑：Platinum Pfx DNA Polymerase(thermo，USA)、dNTPS(thermo，USA)、agarose(Biowest，上海普飛)、gelred(索萊寶，中國)、marker(天根，中國)。

1.2 方法

1.2.1 菌絲體培養(yǎng)

從培養(yǎng)5～7 d的PDA培養(yǎng)基平板上挑取2 mm×2 mm的菌絲塊，將其接種于PDA液體培養(yǎng)基中，25～27 ℃淺層靜置培養(yǎng)10～15 d。然后收集菌絲體，用無菌水漂洗2次，滅菌濾紙吸干水分，用于提取基因組DNA。

1.2.2 基因組DNA提取

取0.1 g菌絲體，液氮研磨后加入2%CTAB，用于基因組DNA的提取[16]。以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA純度、NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)(Thermo)檢測DNA濃度，樣品稀釋至50 ng·μL-1，用于rDNA ITS擴(kuò)增。

1.2.3 rDNA ITS擴(kuò)增

參照White等[17]發(fā)表的真菌基因組ITS通用引物及GenBank中公布的桑黃真菌屬(Phellinusbaumii)rDNA ITS序列，設(shè)計(jì)引物：ITS-F(5′-AGTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3′)；ITS-R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。擴(kuò)增體系含10×PCR緩沖液5 μL、10 mmol·L-1dNTPs 1 μL、10 μmol·L-1上下游引物各2 μL、100 ng基因組模板DNA及1 UpfuDNA聚合酶，總體積50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.2.4 rDNA ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

取目標(biāo)產(chǎn)物5 μL，加6×上樣緩沖液1 μL(含30 mmol·L-1EDTA，36%丙三醇，0.05%溴酚藍(lán))，混勻后于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，拍照記錄。

1.2.5 rDNA ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定

將目的條帶位置正確的樣品送擎科生物測序，以PCR引物為起始引物，雙向測通。

1.2.6 序列比較及系統(tǒng)發(fā)育分析

用MEGA 7.0.14進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和進(jìn)化樹構(gòu)建，以最大似然法(construct/test maximum likelihood tree)構(gòu)建分子進(jìn)化樹，進(jìn)行1 000次自展抽值(bootstrap sampling)檢驗(yàn)分子進(jìn)化樹可靠性。Kimura 2-parameter模型計(jì)算遺傳距離，所有對位排列結(jié)果中的空位(gaps)或缺失數(shù)據(jù)(missing data)作完全刪除(complete deletion)處理。

1.2.7 序列比對分析

用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)軟件進(jìn)行序列在線比對分析，同時(shí)利用clustal W-2.1進(jìn)行2條序列的比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃rDNA ITS序列PCR擴(kuò)增

以桑黃菌絲體基因組DNA為模板，ITS-F/ITS-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳分析，檢測到特異性擴(kuò)增片段，測試樣品擴(kuò)增產(chǎn)物長度為800 bp左右(圖1)，符合預(yù)期值。

2.2 基于rDNA ITS序列的桑黃真菌系統(tǒng)發(fā)育分析

對桑黃rDNA ITS擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，并依據(jù)rDNA ITS序列信息，以最大似然法(construct/test maximum likelihood tree)構(gòu)建分子進(jìn)化樹，桑黃真菌顯著的區(qū)分為3個(gè)類群(圖2)。其中，S3、S28、FJ940908.1、DQ103884.1為一組，S13、S19、S27為一組，其余S1、S2、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S15、S17、S21、S22、S23、S26、SKHCH等為一組。

Marker分子量從下到上依次為：200、400、600、800、1 000、1 500 bpThe molecular weight of marker from bottom to top were 200， 400， 600， 800， 1 000 and 1 500 bp.圖1 桑黃rDNA ITS序列PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of rDNA ITS of Phellinus baumii

2.3 基于rDNA ITS序列的桑黃遺傳距離分析

對22個(gè)桑黃真菌種間及種內(nèi)的遺傳距離進(jìn)行分析，結(jié)果表明，桑黃真菌存在明顯的遺傳分化，屬種間遺傳趨異度顯著高于種內(nèi)，S13、S19、S27組存在較高的種內(nèi)遺傳多樣性(表2)。其中，S27在ITS區(qū)存在較高趨異度(ITS=0.030)；其次為S13、S28趨異度(ITS=0.028)。而S1、S2、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S15、S17、S21、S22、S23、S26、SKHCH組內(nèi)基本不存在遺傳多樣性。

2.4 桑黃真菌rDNA ITS序列分析

對3類桑黃真菌的rDNA ITS序列進(jìn)行BLAST分析，本文測定的桑黃序列Group Ⅰ(S3、S28)與GenBank中已登錄的Fuscoporiagilva(楊樹桑黃)真菌rDNA ITS序列(登錄號DQ103884.1)顯示的序列一致，相似性為100%(圖3)。Group Ⅱ(S13、S19、S27)與GenBank中已登錄的Inonotusbaumii(丁香桑黃)真菌rDNA ITS序列(登錄號FJ940908.1)的同源性較高，相似性為99%(圖4)。而Group Ⅲ(S1、S2、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S15、S17、S21、S22、S23、S26、SKHCH)與GenBank中已登錄的Sanghuangporussanghuang(野生桑樹桑黃)真菌rDNA ITS序列(登錄號KT693275.1)的同源性較高，相似性為99%(圖5)。

圖2 基于桑黃真菌rDNA ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig.2 Phylogenetic tree based on rDNA ITS sequences of Phellinus baumii

表2桑黃菌各株間的遺傳距離分析

Table2Genetic distance among Sanghuang strains

SKHCHS9S8S7S6S5S4S3S28S27S26S23S22S21S2S19S17S15S13S11S10S1SKHCHS90S800S7000S60000S500000S4000000S30.0250.0250.0250.0250.0250.0250.025S280.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250S270.0300.0300.0300.0300.0300.0300.0300.0040.004S2600000000.0250.0250.030S2300000000.0250.0250.0300S2200000000.0250.0250.03000S2100000000.0250.0250.030000S200000000.0250.0250.0300000S190.0280.0280.0280.0280.0280.0280.0280.0030.0030.0030.0280.0280.0280.0280.028S1700000000.0250.0250.030000000.028S1500000000.0250.0250.030000000.0280S130.0280.0280.0280.0280.0280.0280.0280.0030.0030.0030.0280.0280.0280.0280.02800.0280.028S1100000000.0250.0250.030000000.028000.028S1000000000.0250.0250.030000000.028000.0280S100000000.0250.0250.030000000.028000.02800

圖3 S3與DQ103884.1(楊樹桑黃)rDNA ITS序列比對分析Fig.3 Sequence analysis of rDNA ITS of S3 and Fuscoporia gilva by Clustal W

圖4 S13與FJ940908.1(丁香桑黃)rDNA ITS序列比對分析Fig.4 Sequence analysis of rDNA ITS of S13 and Inonotus baumii by Clustal W

圖5 S23與KT693275.1(桑樹桑黃)rDNA ITS序列比對分析Fig.5 Sequence analysis of rDNA ITS of S23 and Sanghuangporus sanghuang by Clustal W

3 結(jié)論與討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，位于18S rDNA及28S rDNA間的rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列分析技術(shù)由于進(jìn)化速率快、穩(wěn)定性好和測序方便，已廣泛運(yùn)用到多種真菌種屬水平的分類鑒定研究中[18]。利用ITS序列分析技術(shù)，我們鑒定了杭州、麗水及安徽金寨等地采集到的22個(gè)桑黃樣品。根據(jù)ITS序列聚類分析，將22個(gè)桑黃樣品明顯的區(qū)分為3個(gè)類群。其中，S3、S28為一組，S13、S19、S27為一組，其余S1、S2、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S15、S17、S21、S22、S23、S26、SKHCH為一組。

同時(shí)，我們通過BLAST序列比對，分析了以上3類桑黃菌株的rDNA ITS序列，從供試樣品中成功鑒定出2份楊樹桑黃(Fuscoporiagilva)分別為S3、S28；3份丁香桑黃(Inonotusbaumii)分別是S13、S19、S27；17份桑樹桑黃(Sanghuangporussanghuang)分別為S1、S2、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S15、S17、S21、S22、S23、S26、SKHCH。

本文22份桑黃樣品的rDNA ITS測序結(jié)果為Fuscoporiagilva、Inonotusbaumii、Sanghuangporussanghuang的系統(tǒng)發(fā)育地位及廣泛應(yīng)用的桑黃品種鑒定提供了可靠的分子證據(jù)，同時(shí)證明rDNA ITS測序技術(shù)能夠有效鑒定桑黃種質(zhì)。利用該技術(shù)準(zhǔn)確區(qū)分了3種桑黃真菌，從分子水平明確提出外觀近似的桑黃Fuscoporiagilva、Inonotusbaumii、Sanghuangporussanghuang不是同一個(gè)種(圖6)，而是客觀存在且相互獨(dú)立的生物種。這一結(jié)果有助于明確桑黃真菌種類，也能為桑黃種質(zhì)資源鑒定、菌株培養(yǎng)及有效成分功能鑒定提供參考。

盡管本研究利用rDNA ITS測序技術(shù)可將子實(shí)體外觀形態(tài)相似的桑黃種質(zhì)明確區(qū)分為3類，但當(dāng)前NCBI中GenBank登錄的與桑黃相關(guān)的序列信息還不夠全面；同時(shí)桑黃子實(shí)體形態(tài)也會因所處地理位置及寄主的不同而發(fā)生改變；此外，大量的桑黃功效研究所使用的材料也至少包含了桑樹桑黃、丁香桑黃、楊樹桑黃或火木層孔菌等，究竟哪個(gè)種類起到主要作用也不得而知，這些現(xiàn)狀均導(dǎo)致學(xué)者對桑黃種屬的確定始終存在較大爭議，因此本研究鑒定區(qū)分出的3類桑黃屬的明確分類地位還需要進(jìn)一步的研究。同時(shí)，本文雖然成功地將ITS序列作為分子標(biāo)記對供試樣品種類進(jìn)行了鑒定和區(qū)分，但由于ITS在種內(nèi)間隔區(qū)上表現(xiàn)的差異較小，其不適宜屬內(nèi)種的區(qū)分，因此，對于本試驗(yàn)中3類桑黃屬內(nèi)種的遺傳多樣性有待進(jìn)一步研究。

A，桑樹桑黃；B，丁香桑黃；C，楊樹桑黃。A， Sanghuangporus sanghuang; B， Inonotus baumii; C， Fuscoporia gilva.圖6 野生桑黃子實(shí)體Fig.6 Fruit bodies of wild Sanghuang