邱堯　岳毅剛　邵家松

[摘要]目的：探索miR-199b對HaCaT細(xì)胞增殖、遷移及對VEGFA、JAG1、SET信號(hào)通路的影響。方法：轉(zhuǎn)染miR-199b上調(diào)與下調(diào)慢病毒到人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT）。分為miR-199b上調(diào)（up）、miR-199b下調(diào)（dowm）、空載對照（NC組）三個(gè)組，進(jìn)行CCK8、凋亡、周期試驗(yàn)，并采用RT-PCR技術(shù)檢測VEGFA、JAG1、SET基因的表達(dá)，采用WB技術(shù)檢測miR-199b對下游蛋白變化（如VEGFA、JAG1等分子）的影響。結(jié)果：miR-199b up組OD450/fold值顯著高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）、miR-199b down組OD450/fold值略低于NC組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與NC組相比，G1期miR-199b up組與miR-199b down組的細(xì)胞增多（P<0.05）；在S期，miR-199b up組及miR-199b down組的細(xì)胞減少（P<0.05）；在G2/M期，miR-199b up組及miR-199b down組的細(xì)胞減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與NC組比較，miR-199b up組凋亡細(xì)胞百分比下降（P<0.05）、miR-199b down組凋亡細(xì)胞百分比上升（P<0.05）；SET在miR-199b up組的表達(dá)明顯低于NC組，在miR-199b down組表達(dá)明顯高于NC組。從定量PCR結(jié)果可以看出，HaCaT細(xì)胞中，miR-199b up組JAG1表達(dá)豐度略高于NC組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），miR-199b down組JAG1表達(dá)豐度明顯高于NC組（P<0.05）；miR-199b up組VEGFA表達(dá)豐度明顯低于NC組（P<0.05）、miR-199b down組VEGFA表達(dá)豐度明顯高于NC組（P<0.05）；miR-199b up組SET表達(dá)豐度小于NC組（P>0.05）、miR-199b down組SET表達(dá)豐度明顯大于NC組（P<0.05）。結(jié)論：miR-199b可抑制VEGF、JAG1、SET蛋白的表達(dá)，為其靶基因，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，延長細(xì)胞周期，并抑制細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]微小RNA；增殖；凋亡；分化；信號(hào)通路；慢性創(chuàng)面

[中圖分類號(hào)]R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2019）01-0089-04

Study on the Role and Mechanism of miR-199b in Promoting Vascularization of Chronic Wound

QIU Yao，YUE Yi-gang，SHAO Jia-song，HUO Qun，ZHANG Min

（Department of Plastic Surgery，the Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001，Guangxi，China）

Abstract： Objective To explore the effects of miR-199b on proliferation and migration of HaCaT cells， as well as VEGFA， JAG1 and SET signaling pathways. Methods Transfection of miR-199b mimics and inhibitor lentivirus into human immortalized epidermal cells HaCaT was performed. The study was divided into three groups： miR-199b up， miR-199b down and no-load control. CCK8， cycle and scratch test were conducted， and the expression of VEGFA， JAG1 and SET genes were detected by RT-PCR， and the downstream protein changes （such as VEGFA， JAG1 and other molecules） were detected by WB technology. Results The OD450/fold value of miR-199b up group was significantly higher than that of NC group （P<0.05）. The OD450/fold value of miR-199b down group was slightly lower than that of NC group （P>0.05）. In the G1 phase， cells in the miR-199b up and down group were increased compared to the control group （P<0.05）. At the S stage， compared with the control group， the cells in the miR-199b up and down group were reduced （P>0.05）. In the G2/M phase， compared with the control group， the cells in the miR-199b up and down group were reduced （P>0.05）. Compared with the NC group， the percentage of apoptotic cells in the miR-199b up group decreased （P<0.05） and the percentage of apoptotic cells in the miR-199b down group increased （P<0.05）. The expression of SET was significantly lower in the miR-199b up group than in the NC group， and significantly higher in the miR-199b down group than in the NC group. According to the quantitative PCR results， the expression abundance of JAG1 in the miR-199b up group was slightly higher than that in the NC group （P>0.05）. The expression abundance of JAG1 in the miR-199b down group was significantly higher than that in the NC group （P<0.05）. The expression abundance of VEGFA in the miR-199b up group was significantly lower than that in the NC group （P<0.05）. The expression abundance of VEGFA in the miR-199b down group was significantly higher than that in the NC group （P<0.05）. SET expression abundance of miR-199b up group was smaller than that of NC group （P>0.05）. The expression abundance of SET in the miR-199b down group was significantly greater than that in the NC group （P<0.05）. Conclusion miR-199b is the target gene of VEGF， JAG1 and SET proteins by inhibiting their expression.It can promote cell proliferation， prolong cell cycle and inhibit cell apoptosis.

Key words： miRNA； proliferation； apoptosis； differentiation； signaling pathways；chronic wound

近年來，IPS細(xì)胞誘導(dǎo)并定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而在實(shí)驗(yàn)體內(nèi)形成新生血管的研究越來越受到人們的重視，美國學(xué)者Samuel等人使用人體IPS細(xì)胞制造出了能在實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)存活280d的人造血管，并且其表現(xiàn)的生物學(xué)功能與正常血管一致。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為糖尿病及心血管疾病等的治療方法帶來了全新的思考，但迄今為止，國內(nèi)外關(guān)于IPS細(xì)胞在治療慢性創(chuàng)面領(lǐng)域的研究報(bào)道尚不多見。

基于目前臨床上對于慢性創(chuàng)面治療尚無有效方法的困境，回顧過去胚胎干細(xì)胞定向分化血管內(nèi)皮細(xì)胞治療慢性創(chuàng)面的良好效果，聯(lián)系當(dāng)今世界IPS細(xì)胞對于再生醫(yī)學(xué)及新生血管形成的重大研究成果，筆者推測：由IPS細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞可在慢性創(chuàng)面環(huán)境中形成新生血管并促進(jìn)慢性創(chuàng)面血管化，進(jìn)而加速慢性創(chuàng)面的愈合。目前已有研究顯示，miR-199b參與了IPS分化成內(nèi)皮細(xì)胞的過程，并與JAG1和VEGF通路存在靶向關(guān)系[1]，但該研究并未探討miR-199b對內(nèi)皮細(xì)胞的功能影響，如增殖、周期、血管形成等。因此，深入研究miR-199b促進(jìn)慢性創(chuàng)面血管化的作用及其機(jī)制具有重要意義。

因此，進(jìn)一步探索miR-199b在參與細(xì)胞分化形成新生血管促進(jìn)慢性創(chuàng)面血管化、改善創(chuàng)面血流供應(yīng)、加速創(chuàng)面愈合的這一過程中可能產(chǎn)生的功能及其作用機(jī)制，為推動(dòng)慢性創(chuàng)面治療的新方法提供一定的理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞：293T（慢病毒的包裝細(xì)胞）；大腸桿菌菌株DH5 α（用于擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒）；人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）。

1.2 試劑：GeneRuler 1 kb DNA Ladder（Thermo Scientific）；Thermo Scientific（Generay）；Restriction Endonuclease（NEB）；Taq Plus DNA polymerase（Vazyme）；T4 DNA ligase（Thermo Scientific）；Primer（Generay）；TOP10 competent cell（Genechem）；EndoFree Midi Plasmid Kit（Tiangen）；CCK-8（Sigma）；胎牛血清 FBS（Ausbian）；DMEM（Corning）；凋亡試劑盒（eBioscience）；PI（Sigma）；Rnase A（Fermentas）；Trizol（上海普飛）；M-MLV（promega）；dNTPs（promega）；Oligo（dT，上海生工）；Bulge-LoopTM miRNA qPCR Primer Set（廣州銳博）；Rnase Inhibitor（promega）；Primer（R&F，上海吉?jiǎng)P）；SYBR Master Mixture（Takara）；BCA Protein Assay Kit（碧云天）；RIPA 裂解液（強(qiáng)）（碧云天）；RIPA 裂解液（上海鼎國生物技術(shù)有限公司）；NP-40裂解液（上海鼎國生物技術(shù)有限公司）；Prestained protein marker（Thermo）；ECL-PLUS/Kit（Thermo）。

1.3 儀器：PCR儀（Applied Biosystems公司）；測序儀（美季生物公司）；數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（天能公司）；凝膠成像儀（天能公司）；細(xì)菌搖床（華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）；Blue Pard隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；移液器（吉爾森公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州佳寶凈化工秳設(shè)備有限公司）；高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；生物安全柜（上海振樣創(chuàng)空氣凈化設(shè)備公司）；96孔板（Cornning）：血球計(jì)數(shù)板（求精）；酶標(biāo)儀（Tecan infinite）；流式細(xì)胞儀（Millipore）；熒光顯微鏡（Olympus）；Nanodrop分光光度計(jì)（Thermo）；穩(wěn)壓電泳儀（上海天能）：超細(xì)勻漿機(jī)（FLUKO公司）；Real time PCR儀器（Roche公司）反轉(zhuǎn)錄耗材（Axygen）穩(wěn)壓電源（電泳用，上海天能）；SDS-PAGE 蛋白電泳儀（上海天能）；蛋白轉(zhuǎn)膜儀（上海天能）；冷凍高速離心機(jī)（Thermo）；PVDF膜（millipore）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 目的基因載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染：利用限制性內(nèi)切酶消化獲得線性化慢病毒載體。引物退火制備mir-199b及miR-199b反向序列片段。將雙酶切線性化的載體和退火雙鏈DNA連接，將產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化。經(jīng)測序后，抽提合格的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至293T（慢病毒的包裝細(xì)胞）中，構(gòu)建出miR-199b up慢病毒及miR-199b down慢病毒。培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的HaCaT細(xì)胞，進(jìn)行正式感染，使用抗生素篩選48h，收集細(xì)胞匯合度70%～80%左右生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，經(jīng)PCR驗(yàn)證上調(diào)與下調(diào)成功后，進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 CCK-8法檢測miR-199b對HaCaT細(xì)胞增殖能力的影響： 將使用慢病毒感染的HaCaT細(xì)胞分為miR-199b up組及miR-199b down組，并增設(shè)加陰性對照病毒感染的細(xì)胞作為空白對照組。將三組細(xì)胞分別接種于96孔板中，共接種5塊板（按檢測時(shí)間點(diǎn)標(biāo)記為1d、2d、3d、4d、5d號(hào)板），于含胎牛血清FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5d。期間分別于第1、2、3、4、5天對相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的96孔板進(jìn)行檢測，檢測前，每孔加100?l試劑（其中10?l CCK-8試劑，剩余90?l為含胎牛血清FBS的DMEM培養(yǎng)基）。于4h后將96孔板置于振蕩器上振蕩 2～5min，選用酶標(biāo)儀450nm檢測OD值。

1.4.3 PI-FACS細(xì)胞周期檢測mir-199b對HaCaT細(xì)胞周期的影響： 分組方式同1.4.2。將3組細(xì)胞感染后第3天傳代，第4天換無血清培養(yǎng)，第5天換正常培養(yǎng)基，5h后檢測miR-199b up、miR-199b down組與對照組處在G1，S以及G2/M期的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例。

1.4.4 凋亡試驗(yàn)檢測mir-199b對HaCaT細(xì)胞遷移能力的影響：分組方式同1.4.2。待各實(shí)驗(yàn)組6孔板細(xì)胞生長至覆蓋率約為70%時(shí)藥物誘導(dǎo)凋亡。若為貼壁細(xì)胞，則上清中細(xì)胞也需收集。胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，與上清細(xì)胞收集于同一個(gè)5ml離心管中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。若為懸浮細(xì)胞，直接收集。1 300rmp離心5min，棄上清，4℃預(yù)冷的D-Hanks（pH=7.2～7.4）洗滌細(xì)胞沉淀。1×binding buffer洗滌細(xì)胞沉淀1次，1 300rmp、離心3min，收集細(xì)胞。200?l 1×binding buffer重懸細(xì)胞沉淀，加入10?l Annexin V-APC染色，室溫避光10～15min。根據(jù)細(xì)胞量補(bǔ)加400～800?l 1×binding buffer，上機(jī)行流式細(xì)胞檢測。

1.4.5 Western blot檢測SET蛋白表達(dá)： 按1.4.2分組，從3組細(xì)胞中分別進(jìn)行蛋白提取。進(jìn)行SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠（分離膠濃度：10%）電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜、封閉加入一抗（目的一抗SET、內(nèi)參一抗GAPDH）、二抗（rabbit IgG、mouse IgG），孵育后采用ECL法結(jié)合X光片蛋白相對表達(dá)量經(jīng)內(nèi)參校正后，經(jīng)Image J軟件進(jìn)行分析。

1.4.6 Real time PCR檢測VEGFA、JAG1基因表達(dá)：分別對3組細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，檢測RNA濃度、純度，采用PCR儀反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Real time PCR儀進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，檢測并比對CT值。

1.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，繪圖采用Graphpad Prism 6.0軟件，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測結(jié)果表明：miR-199b up組OD450/fold值顯著高于對照（NC）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；miR-199b down組OD450/fold值低于NC組（P>0.05）。提示miR-199b up組促進(jìn)細(xì)胞增殖。見圖1。

2.5 qPCR檢測結(jié)果顯示：從定量PCR結(jié)果可以看出，HaCaT細(xì)胞中，miR-199b up組JAG1表達(dá)豐度低于NC組（P>0.05），miR-199b down組JAG1表達(dá)豐度明顯高于NC組（P<0.05）；miR-199b up組VEGFA表達(dá)豐度明顯低于NC組（P<0.05）；miR-199b down組VEGFA表達(dá)豐度明顯高于NC組（P<0.05）；miR-199b up組SET表達(dá)豐度低于NC組（P>0.05），miR-199b down組SET表達(dá)豐度明顯高于NC組（P<0.05）。見圖5～7。

3 討論

慢性難愈性創(chuàng)面簡稱慢性創(chuàng)面，是指經(jīng)規(guī)范臨床治療4～8周后仍難愈合或不愈合的創(chuàng)面。在中國，隨著人口老齡化及人們生活水平提高，糖尿病、下肢靜脈潰瘍等發(fā)病率逐年上升，慢性創(chuàng)面發(fā)生率越來越高，已嚴(yán)重影響我國的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)發(fā)展。創(chuàng)面愈合是一個(gè)涉及血管化、上皮化、細(xì)胞外基質(zhì)形成與沉積的復(fù)雜過程，大量研究證實(shí)，局部血運(yùn)不良是造成慢性創(chuàng)面難以愈合的主要原因。迄今為止，在慢性創(chuàng)面的治療上，臨床尚缺乏理想的藥物及方法[2]。因此，深入研究mir-199b促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制，可為IPS細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞以促慢性創(chuàng)面血管化，治療慢性創(chuàng)面的新治療思路提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，具有臨床意義。

MicroRNAs（miRNAs）是一類小的、內(nèi)源性的非編碼RNA，長度約17～25bp，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，可以調(diào)控基因的表達(dá)，在人類基因組中30%的基因都受到miRNAs的調(diào)控[3]。研究表明[4]，miRNAs在轉(zhuǎn)錄后將抑制靶基因表達(dá)，越來越多的研究證明此特性在許多癌癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，也為治療多種疾病提供了潛在治療因子[5-8]。通過targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測，MiR-199b可以與VEGFA、SET、JAG1結(jié)合，并通過抑制靶基因發(fā)揮功能。本次試驗(yàn)中，miR-199b轉(zhuǎn)染人上皮細(xì)胞HaCaT細(xì)胞，經(jīng)qPCR檢測與對照組相比，miR-199b up組抑制VEGFA，JAG1，SET表達(dá)，miR-199b down組促進(jìn)miR-199b up組抑制VEGFA，JAG1，SET表達(dá)，驗(yàn)證miR-199b可以與VEGFA、SET、JAG1結(jié)合，并可能通過抑制這些靶基因發(fā)揮功能。Western blot檢測SET表達(dá)結(jié)果顯示：在miR-199b轉(zhuǎn)染人上皮細(xì)胞HaCaT細(xì)胞中，相比對照組，miR-199b down組促進(jìn)SET表達(dá)，miR-199b up組抑制SET表達(dá)，提示，miR-199b可能靶向抑制SET通路發(fā)揮功能。然而本次CCK-8試驗(yàn)、細(xì)胞周期試驗(yàn)顯示miR-199b對其轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果提示miR-199b對其轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞的凋亡有抑制作用。本次研究結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-199b的HaCaT細(xì)胞中VEGFA、JAG1、及SET的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞增殖加速，細(xì)胞凋亡被抑制，考慮此結(jié)果可能與細(xì)胞周期阻滯水平降低有關(guān)。JIAN CAO等[9]在研究miR-146a和miR-21通過調(diào)控Notch信號(hào)通路共同調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖的過程中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-146a的VSMCs中Notch2蛋白的表達(dá)明顯降低，但細(xì)胞增殖加速，miR-146a和miR-21在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中顯著上調(diào)，并加速血管平滑肌細(xì)胞的生長和細(xì)胞周期進(jìn)程。這提示雖然對包括VEGFA、JAG1在內(nèi)的促細(xì)胞增殖作用的靶基因有抑制作用，miRNAs仍可能在某些情況下起到促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。據(jù)此筆者推測，在IPS細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的過程中，miR-199b可通過VEGFA，JAG1，SET通路發(fā)揮作用，并最終通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡來促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成，從而改善慢性創(chuàng)面的血供，進(jìn)而起到促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合的作用。

綜上所述，此次研究顯示，miR-199b可能為VEGFA、JAG1、及SET的靶基因，并可促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，為慢性創(chuàng)面血管化提供了新的治療思路。

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[收稿日期]2018-08-13 [修回日期]2018-09-30

編輯/賈敏

本文引用格式：邱堯，岳毅剛，邵家松，等.miR-199b促進(jìn)慢性創(chuàng)面血管化的作用及機(jī)制研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（1）：89-92.