方 茜， 宗 宇， 凌丹燕， 陳振華， 湯騰躍， 路 梅， 郭衛(wèi)東

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004;2.金華市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 金華 321000;3.浙江省麗水市景寧縣農(nóng)業(yè)局，浙江 麗水 323500;4.金華市婺城區(qū)雅畈鎮(zhèn)人民政府，浙江 金華 321000)

我國藍莓栽培起步晚，發(fā)展迅速.從20世紀80年代開始引種栽培藍莓至今，已經(jīng)形成了東北地區(qū)、山東半島、長江中下游和云貴高原等幾個藍莓主要產(chǎn)區(qū)[1]，長江中下游地區(qū)尤以浙江省和江西省的栽培面積較大.‘夏普藍’(Sharpblue)是浙江省藍莓的主栽品種之一，屬于南高叢藍莓品種群，具有花期晚、長勢旺盛、結(jié)果性能優(yōu)良和早熟等優(yōu)點[2-3].2014—2015年，浙江省金華市藍莓發(fā)生嚴重病害，該病害初期危害藍莓花序，造成花序腐爛枯萎.病原侵染果實后，果實出現(xiàn)褐色凹陷，逐漸腐爛干癟，最終造成落果，癥狀與戴啟東等[4]報道的藍莓灰霉病相似.經(jīng)田間初步調(diào)查發(fā)現(xiàn)，藍莓栽培品種發(fā)病情況較為普遍，其中‘夏普藍’最易受病害侵染，植株發(fā)病率高達46%.該病害嚴重影響了藍莓果實品質(zhì)和產(chǎn)量，給藍莓種植企業(yè)和種植戶造成了重大經(jīng)濟損失，但該病害是否為藍莓灰霉病尚待確認，引起該病害的病原菌尚不清楚.

能夠引起藍莓灰霉病的病原菌類型較為廣泛，其中葡萄孢屬(Botrytis)真菌是報道最多的一類致病菌.葡萄孢屬真菌可以侵染葡萄、番茄、辣椒、茄子等多種重要的經(jīng)濟作物，引起灰霉病、葉疫病、莖腐病等病害[5-6].Smith[7]發(fā)現(xiàn)葡萄孢屬真菌可以引起南高叢藍莓(Vacciniumcorymbosum)花序枯萎病，Austin[8]研究表明,美國東南部藍莓主產(chǎn)區(qū)由于花序遭受葡萄孢屬真菌侵染導致嚴重減產(chǎn).隨著藍莓在我國種植面積的不斷增加和種植年限的增長，藍莓灰霉病對我國藍莓產(chǎn)業(yè)的影響日益凸顯.戴啟東等[4]最早在國內(nèi)鑒定了藍莓灰霉病的病原菌為灰葡萄孢菌(B.cinerea)，該病原菌能夠侵染藍莓葉片、果柄和果實等部位，初期多從葉尖形成“V”形病斑，逐漸向葉內(nèi)擴展，形成灰褐色病斑，后期病斑上著生灰色霉層，被感染的果實軟化腐爛，風干后，果實干癟、僵硬.在設(shè)施栽培條件下該病發(fā)生嚴重，但因其引起的癥狀類似凍害損傷而被忽視，造成大面積減產(chǎn)，因此亟需對浙江金華及周邊地區(qū)藍莓種植園中出現(xiàn)的疑似灰霉病進行確定，并分離和鑒定其致病菌.

為確定該藍莓病害并分離和鑒定其致病菌，采集‘夏普藍’病樣材料，通過病原菌分離、致病性檢測、形態(tài)觀察和rDNA-ITS序列分析相結(jié)合的方法進行了病原菌的分離和鑒定，以期為藍莓灰霉病和相關(guān)病害防治提供參考.

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查和樣品采集

2014年3月—2015年3月期間，對浙江省金華市雅畈鎮(zhèn)藍莓種植基地進行灰霉病發(fā)生和危害情況調(diào)查.對典型的感病花序和果實進行癥狀記錄并拍照，采集染病植株的花序和果實等病樣共50份.

1.2 病樣的分離和純化

采集‘夏普藍’花序上帶霉層的花萼及果實上水漬狀果肉，通過組織分離法和單孢分離法對病原菌進行分離純化[9].用自來水沖洗感病材料上的泥沙，在病健交界處切取邊長2 mm的方形組織，使用75%乙醇消毒后再用無菌水洗去殘余的乙醇.將病原菌株接種到PDA培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置為：20 ℃，16 h光照/8 h黑暗.每隔4 d觀察菌落生長狀態(tài)、產(chǎn)孢情況等特征.在PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)純化后的菌株，3 d后放置4 ℃保存.

1.3 病原菌的致病性檢測

通過驗證柯赫氏法則的方法進行病原菌的致病性檢測[9].以‘夏普藍’的健康且規(guī)格一致的果實和葉片為試材，先用75%酒精表面消毒，再用無菌水清洗3次，晾干后備用.用無菌的打孔器在純化培養(yǎng)5 d的病原菌平板上打孔，制作直徑為5 mm的菌餅.用無菌的3號昆蟲針在表面消毒過的試材表面針刺“+”形(直徑5 mm，深度0.5 mm).每個試材針刺一個“+”形，在其上接種1個菌餅，8個重復；設(shè)空白PDA培養(yǎng)基接種作為對照.在光照培養(yǎng)箱中20 ℃下保濕培養(yǎng)，光照條件為每天16 h光照/8 h黑暗.逐天觀察發(fā)病情況，選取發(fā)病癥狀典型的試材，進行病原菌的再分離與鑒定.

1.4 病原菌形態(tài)特征觀察

將病原菌菌株純化后接種到PDA平板上，置于20 ℃生化培養(yǎng)箱，光照條件為16 h光照/8 h黑暗，培養(yǎng)7 d.在光學顯微鏡下觀察菌株菌絲和孢子形態(tài)等特征，進行病原菌的形態(tài)學鑒定.

1.5 病原菌rDNA-ITS的擴增和序列分析[10]

收集培養(yǎng)5 d的病原菌菌絲，采用改良的CTAB法提取其基因組DNA.以基因組DNA為模板，ITS1/ITS4為引物(見表1)，進行PCR擴增.反應(yīng)體系和擴增條件參照文獻[10]方法.PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序.

表1 本研究中所用的ITS1和ITS4引物序列[11]

將擴增得到的rDNA-ITS序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)登錄的序列進行比對分析后，采用MAGA 7軟件[12]構(gòu)建病原菌物種樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病害癥狀觀察

2014年3月上旬，在藍莓種植基地發(fā)現(xiàn)‘夏普藍’受害花序.被侵染花瓣呈褐色、干枯；部分花序表層已產(chǎn)生粉色網(wǎng)狀霉層(見圖1 a)，霉層內(nèi)含有大量的分生孢子.同年4月下旬，‘夏普藍’果實出現(xiàn)被侵染的癥狀.受害果實組織先呈水漬狀，接著出現(xiàn)軟化腐爛，最終干枯皺縮(見圖1 b～1e).對藍莓果實的品質(zhì)和產(chǎn)量造成嚴重影響.與其他藍莓品種相比，‘夏普藍’花萼宿存，不容易脫落；坐果后果萼較直立，萼洼較深，空間狹小，更容易受到灰霉病菌的侵染.

a：染病花序1；b：染病花序2；c：病原菌入侵果實；d：果實軟化腐爛；e：受侵染果實；f：健康果實

2.2 病原菌致病性檢測

從發(fā)病果實病原交界處分離得到疑似病原菌菌株8株，分別命名為X1-1，X1-2，X1-3，X1-4，和X2-1，X2-2，X2-3，X2-4.將疑似菌株分別進行柯赫氏法則驗證.實驗結(jié)果顯示，菌株X1-1回接健康試材5 d后，在接種的果實處組織出現(xiàn)軟化腐爛現(xiàn)象，葉片處出現(xiàn)褐色病斑，均與自然發(fā)病癥狀相同；而對照組中未觀察到相似的發(fā)病癥狀.從發(fā)病處組織中進行病原物的再分離，新得菌株與接種菌株在PDA固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀一致，表明菌株X1-1是引起藍莓灰霉病的病原菌.

2.3 病原菌形態(tài)學鑒定

在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株X1-1，一開始菌絲為白色絨狀；培養(yǎng)7 d后，菌絲布滿直徑為9 cm的培養(yǎng)皿.隨后菌絲顏色逐漸變深，呈灰褐色；氣生菌絲生長旺盛，呈絲絨狀(見圖3 a).10 d后，菌絲間開始出現(xiàn)大量黑色顆粒；15 d開始形成大量不規(guī)則的散生黑色菌核，菌核直徑為2～6 mm(見圖3 b).在光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌株X1-1的分生孢子梗淡褐色，叢生，大小為(150～300)μm×(10～15)μm，呈直立或稍彎曲狀態(tài)，具隔膜(見圖3c)；頂端有末端膨大的分枝(見圖3d)，分枝的小梗上聚生眾多淡褐色卵圓形分生孢子，大小為(10～15)μm×(6～9)μm(見圖3e～3f).

a：菌株接種果實；b：對照組果實；c：菌株接種葉片；d：對照組葉片

a：菌絲；b：菌核；c：菌絲膨大(400×)；d：叢生分生孢子梗(400×)；e：分生孢子梗著生分生孢子(400×)；f：分生孢子(400×)

2.4 致病菌rDNA-ITS序列分析

病原菌X1-1的核糖體rDNA-ITS PCR反應(yīng)得到大小約500 bp的擴增片段.該片段經(jīng)生物公司測序后，在GenBank中進行同源序列比對.比對結(jié)果表明，菌株X1-1(NCBI序列號：KT343755)與灰葡萄孢菌B.cinerea(NCBI序列號：KM265453,KJ744343)的序列相似度為100%.結(jié)合菌絲和分生孢子的形態(tài)觀察結(jié)果，藍莓灰霉病病原菌X1-1可鑒定為灰葡萄孢菌(B.cinerea)，屬于絲孢綱(Hyphomycetes)、叢梗孢目(Miniliales)、叢梗孢科(Moniliaceae)、葡萄孢屬(Botrytis)真菌.

3 討 論

通過形態(tài)觀察、核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)序列分析和柯赫氏法則驗證等方法，對引起藍莓品種‘夏普藍’灰霉病的病原菌進行了鑒定，確認引起‘夏普藍’灰霉病的病原菌為灰葡萄孢菌(B.cinerea).灰葡萄孢菌是植物重要的病原真菌之一，主要引起葡萄等果樹和菜蔬的灰霉病[5，13].據(jù)報道，灰葡萄孢菌目前已成為導致北美藍莓經(jīng)濟價值損失嚴重的病害之一，尤其在加拿大新不倫瑞克省及緬因州等沿海地區(qū)，長期的潮濕環(huán)境導致藍莓灰霉病發(fā)病率極高[7].灰葡萄孢菌初期侵染發(fā)生在開花時期，通過柱頭部位侵入，潛伏在壞死組織，晚期在適當溫度及濕度下恢復生長，侵入果實及葉片等部位[14].

圖4 基于rDNA-ITS序列的灰葡萄孢菌及相似屬真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

灰葡萄孢菌的傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定主要從菌核和分生孢子形態(tài)、分生孢子梗分枝特點等方面.但Cotoras等[15]研究認為，不同培養(yǎng)情況下灰葡萄孢菌菌落形態(tài)具有較高的變異性，僅從傳統(tǒng)形態(tài)進行菌種的鑒定存在諸多不確定性.真菌種內(nèi)菌株間rDNA-ITS序列高度保守，彌補了傳統(tǒng)形態(tài)學的不足，被廣泛應(yīng)用于真菌病原鑒定，但在藍莓病原菌鑒定方面罕見報道.Kwon等[16]運用rDNA-ITS首次對藍莓采后灰霉病病原菌進行了鑒定，為藍莓相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ).但利用rDNA-ITS序列相似度判斷真菌種類時會出現(xiàn)不同種間甚至不同屬間存在較高的序列相似度，難以區(qū)別病原菌種類的情況.例如，Zhang等[17]在研究蠶豆褐斑病時分離得到疑似葡萄孢菌屬真菌病原菌，經(jīng)序列比對分析發(fā)現(xiàn)，雖然該分離菌的rDNA-ITS與B.cinerea的相似性為100%，但其菌核呈環(huán)狀分布于PDA培養(yǎng)基，不同于后者的散狀分布；經(jīng)后續(xù)深入研究發(fā)現(xiàn),該分離菌為新種B.fabiopsis.本研究分離株X1-1的rDNA-ITS序列與菌株B.cinerea，Botryotiniafuckeliana等的序列相似度均為100%.在形態(tài)觀察時發(fā)現(xiàn)，除B.cinerea外，其余菌株與病原菌X1-1均存在明顯形態(tài)差異.因此,傳統(tǒng)形態(tài)學觀察和分子技術(shù)研究結(jié)果相結(jié)合，確認菌株X1-1為灰葡萄孢菌.單獨利用形態(tài)學或者ITS序列分析均不能有效區(qū)分葡萄孢屬中的部分種，只有2種方法結(jié)合才能確保鑒定結(jié)果的準確性.

迄今為止，國內(nèi)僅有少數(shù)幾例藍莓灰霉病病原菌分離和鑒定的報道.Saito等[18]研究發(fā)現(xiàn),引起北美藍莓灰霉病的病原菌為B.pseudocinerea，與本研究、戴啟東等[4]、Kwon等[16]報道確定的病原菌為B.cinerea不一致.葡萄孢屬的其他種如B.caroliniana,B.fabiopsis和B.galanthin等[19]也能夠引起植物灰霉病，但以上病原菌能否引起藍莓灰霉病尚不清楚，在后續(xù)研究中需要在藍莓上回接能夠?qū)е禄颐共〉钠渌N，從而進一步掌握藍莓灰霉病的發(fā)生規(guī)律及防治方法.

藍莓果實主要用于鮮食，采用化學藥劑防治灰霉病不符合果品綠色生產(chǎn)規(guī)范，且可能造成果實農(nóng)藥殘留[20].因此，生產(chǎn)上應(yīng)該從提高栽培管理技術(shù)、篩選抗病品種和生物防治等多方面進行藍莓灰霉病的綜合防治[1，4，20].栽培過程中要及時清理防病植株病殘體，設(shè)施栽培條件下要控制環(huán)境濕度.雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)對灰霉病完全免疫的藍莓品種，但‘奧尼爾’等品種具有一定的抗病能力[21].灰霉病的生物防治可選用具有不易被人體吸收、無任何潛在過敏性和安全高效等特點的拮抗菌或真菌次生代謝物[20，22-23].已有枯草芽孢菌(Bacillussubtilis)和假絲酵母(Candidaguilliermondii)[23]等作為拮抗菌抑制灰葡萄孢菌生長的報道.此外，周?；鄣萚20]研究表明，納他霉素和維生素C復配可以用于藍莓灰霉病防治.但拮抗菌和次生代謝物目前僅有藍莓采后貯藏的抑菌研究，尚未見到田間栽培使用報道.這2類生物防治劑可以減少甚至替代化學抑菌劑，在藍莓灰霉病和其他真菌性病害防治中具有良好的應(yīng)用前景.