王 娟，吳發(fā)印,徐海麗

(遵義醫(yī)學院第五附屬(珠海)醫(yī)院口腔頜面外科，廣東 珠海 519100)

涎腺黏液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma，MEC)是涎腺中最常見的惡性腫瘤,約占所有惡性唾液腺的35%，占所有涎腺腫瘤的3%～15%,其中80%發(fā)生于腮腺，以細胞多形性為特點，包括表皮樣細胞、中間細胞和黏液細胞[1]。目前發(fā)現(xiàn)除低劑量放療或外傷可能有一定誘導作用外，MEC病因尚不明確,診斷方式存在缺陷，治療方式還很有限。到目前為止，融合基因與腫瘤存在因果關系，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的融合基因總數(shù)達兩萬多個[2]，在人類惡性腫瘤中20%發(fā)生基因融合[3]，其中多種融合基因被認為是腫瘤的重要診斷和預后標志物，并成為治療的新靶點。融合基因CRTC1-MAML2[4]參與MEC的生長與維持，是目前在MEC中發(fā)現(xiàn)的唯一的細胞遺傳學改變，超過55%的MEC存在這種融合基因，CRTC1-MAML2融合陽性MEC患者的存活率明顯高于CRTC1-MAML2融合陰性MEC患者[5]。CRTC1-MAML2作為MEC中一個特定的分子標志物,為MEC靶向治療提供了新的方向?，F(xiàn)就CRTC1-MAML2融合基因在涎腺MEC的發(fā)生、診斷、治療中的研究進展進行綜述。

1 融合基因CRTC1-MAML2

1.1CRTC1-MAML2融合基因的來源與發(fā)現(xiàn) 融合基因CRTC1-MAML2[6]是由于染色體t(11;19)(q12;p13)的易位，導致在染色體19p13上的外顯子基因CRTC1(也被稱為TORC1，MECT1或WAMTP1基因)與染色體11q12上的MAML2基因斷裂發(fā)生了融合產(chǎn)生。t(11;19)(q12;p13)的易位由Nordkvist等[7]發(fā)現(xiàn)并首先描述，目前CRTC1-MAML2基因(GenBank AY040324)的反復易位已被確定為大多數(shù)MECs的潛在遺傳事件。CRTC1-MAML2融合基因在肺MEC[8]，淚腺MEC[9]，甲狀腺[10]及皮膚汗腺瘤[11]中均有報道。Tirado等[10]分析了55例原發(fā)性唾液腺腫瘤，包括22例MEC，以確定CRTC1-MAML2融合轉(zhuǎn)錄本與腫瘤類型的關系，22例原發(fā)性唾液腺中18例(81%)和3例MEC甲狀腺中1例融合轉(zhuǎn)錄呈陽性。在低、中、高水平以及低、高水平MEC中均檢測到該轉(zhuǎn)錄本。22例原發(fā)性非MEC唾液腺癌的轉(zhuǎn)錄本均為陰性，雖然在55例唾液腺癌中11例沃辛瘤有4例(36%)的轉(zhuǎn)錄本呈陽性，但是研究證明CRTC1-MAML2表達陽性的沃辛瘤多為存在壞死和化生的特殊病例[12]。目前尚未在其他唾液腺癌中發(fā)現(xiàn)表達CRTC1-MAML2。隨后亦未在其他唾液腺癌中得到證實。

1.2CRTC1-MAML2融合基因的功能 目前關于CRTC1-MAML2融合基因致癌機制的研究還有限。一個被廣泛接受的致癌機制是：CRTC1-MAML2融合基因可以被劃分為單獨的模塊域，每個組成元件都能夠?qū)崿F(xiàn)或執(zhí)行特定的功能，每一個元件錯亂都可能導致MEC的形成。CRTCs[13]是一個主要調(diào)節(jié)環(huán)腺苷酸效應元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)轉(zhuǎn)錄因子活性的蛋白質(zhì)家族,是保證CREB活性的必需條件。其中CRTC1啟動子在融合陽性MEC和少數(shù)正常成人唾液腺中有報道，但CRTC1蛋白在正常唾液腺的分布尚不清楚。Jaskoll等[14]的研究結(jié)果表明，CRTC1蛋白在早期的下頜下腺上皮細胞中表達，隨著分化而消失，但在腫瘤樣病理中重新出現(xiàn)，表明CRTC1可能在下頜下腺胚胎期形態(tài)發(fā)生過程中發(fā)揮作用，但對腺泡分化沒有作用，研究支持MEC腫瘤的發(fā)生起源于前體細胞。CRTC1介導的細胞增殖可能在一定程度上參與了MEC的初始形成。CRTC1激活后引起下游特異性基因LYPD-3轉(zhuǎn)錄激活，從而參與腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移[15]。NOTCH信號通路是一種進化上保守的機制，在此機制中，細胞間的相互作用可能決定細胞的命運，在許多組織的發(fā)育過程中起重要作用。MAML2[16]是NOTCH轉(zhuǎn)錄復合體的一部分，是配體刺激后的轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合序列CSL(c-promoter binding factor-1/suppressor of hairless/LAG-1)和NOTCH受體的核激活形式，是NOTCH靶基因轉(zhuǎn)錄激活的必要條件。Behboudi等[17]對融合陽性MEC融合下游潛在靶點的分析顯示，cAMP/CREB(FLT1和NR4A2)和NOTCH(HES1和HES5)靶基因在融合陽性和融合陰性MECs中的表達存在差異。

另外有研究認為只有CRTC1與MAML2融合才能導致MEC發(fā)生。Komiya等[18]的研究表明在腫瘤中強制表達CRTC1和MAML2不足以引發(fā)轉(zhuǎn)化上皮細胞，而異位表達和(或)誘導表達CRTC1-MAML2則可轉(zhuǎn)化上皮細胞。此外，與NOTCH配位相互作用所需的MAML2區(qū)域在CRTC1-MAML2融合蛋白中不存在，而異常調(diào)控CRTC1-MAML2信號的NOTCH基因也被發(fā)現(xiàn)具有CREB應答啟動子。然而,CRTC1-MAML2融合則完全可以進行轉(zhuǎn)化活動，激活CREB信號。Luk等[19]研究提示只有CRTC1與MAML2融合才可以有效誘導E1A永生的RK3E細胞內(nèi)的病灶形成，而獨立的MAML2、CRTC1并無此功能。進一步的研究認為，MECT1-MAML2融合基因和其蛋白產(chǎn)物可以通過激活cAMP-CERB信號通路和NOTCH信號通路破壞細胞周期和分化功能，或通過干擾NOTCH和CREB信號通路誘導腫瘤發(fā)生是CRTC1-MAML2融合基因的可能致癌機制[20]。雙向調(diào)節(jié)因子(amphiregulin，AREG)是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)配體，已被證明是CRTC1-MAML2融合的下游靶點，在CRTC1-MAML2陽性MEC細胞系中發(fā)揮腫瘤生長和生存作用。Shinomiya等[21]采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應檢測33例MEC中CRTC1-MAML2融合基因，其中包括23例CRTC1-MAML2融合陽性，10融合陰性。在23例融合陽性病例中，17例(73.9%)和14例(60.9%)檢測到AREG和EGFR過表達。在10例融合陰性病例中，1例(10%)和3例(30.0%)檢測到AREG和EGFR過表達。CRTC1-MAML2融合與AREG過表達呈正相關，而與EGFR過表達無關。AREG表達的檢測可能有助于識別CRTC1-MAML2陽性MEC。

2 CRTC1-MAML2融合基因與涎腺MEC的發(fā)生與維持

由染色體t(11;19)易位而產(chǎn)生的CRTC1-MAML2融合基因，在MEC中發(fā)生率為38%～82%[22]。將CRTC1-MAML2轉(zhuǎn)染的RK3E細胞注入5只裸鼠體內(nèi)，14 d內(nèi)5只裸鼠均形成腫瘤，而未經(jīng)CRTC1-MAML2轉(zhuǎn)染的對照組30只裸鼠在3個月內(nèi)未成瘤，證明了CRTC1-MAML2在大鼠上皮細胞RK3E細胞中的表達在裸鼠體內(nèi)是致瘤的，切除的移植瘤繼續(xù)表達融合癌基因，隨后實驗通過生成了一個RNA干擾載體，該載體選擇性地抑制融合蛋白，導致至少90%的MEC細胞菌落生長抑制。與此相反，RNA干擾序列中單個核苷酸的改變使MECT1-MAML2蛋白的抑制能力消失，MEC腫瘤系的生長抑制作用全部消失，表明MEC的發(fā)生可能與CRTC1-MAML2的發(fā)生有因果關系，并且維持MEC的生長，使MEC有可能成為合理治療靶點[18]。研究者用CRTC1-MAML2基因融合誘導培養(yǎng)上皮RK3E細胞的菌落形成，由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化型RK3E細胞能夠在免疫受損小鼠中形成皮下腫瘤，表明在上皮細胞轉(zhuǎn)化中CRTC1-MAML2融合基因的致瘤作用[23-24]。而通過內(nèi)源性消耗CRTC1-MAML2的融合可顯著降低體外MEC細胞及體內(nèi)移植瘤的生長率和生存率，表明CRTC1-MAML2融合基因在MEC的發(fā)生和生長中的作用至關重要[25]。

3 CRTC1-MAML2融合基因在涎腺MEC中的應用

3.1診斷應用 細針穿刺細胞學常在術前作為唾液腺腫瘤的輔助診斷的一部分，為治療方式的選擇提供依據(jù)，但準確率仍存在爭議，其在診斷高級或中級涎腺MEC較為準確，但對低等級腫瘤的診斷存在較大誤差。融合基因CRTC1-MAML2的發(fā)現(xiàn)也為MEC的臨床診斷提供了新的依據(jù)。目前已有案例成功證明了融合基因CRTC1-MAML2在MEC診斷上的意義，F(xiàn)ujimaki等[26]首次通過檢測CRTC1-MAML2融合基因(用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應直接測序技術)確診了MEC。Akaev等[27]報道了1例伴有強烈的腫瘤相關淋巴樣增生的、CRTC1-MAML2表達陽性的特殊類型腮腺MEC，起初組織活檢未檢測到細胞內(nèi)黏液蛋白，未見明確的表皮樣細胞和黏液細胞，最終通過CRTC1-MAML2基因及其蛋白的檢測得到確診。也有研究證明在高等級MEC中有染色體t(11;19)(q12;p13)易位存在，當傳統(tǒng)方法診斷困難時，通過檢測融合基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可能有助于區(qū)分腫瘤類型和分化較差的腺癌或透明細胞癌[28]。因此在診斷不明確的情況下應用分子技術檢測CRTC1-MAML2融合基因及其轉(zhuǎn)錄蛋白可能會對MEC的診斷有所幫助。

3.2分級及預后應用 MEC曾被稱為黏液表皮樣腫瘤，第2版世界衛(wèi)生組織頭頸腫瘤分類中明確黏液表皮樣腫瘤為惡性腫瘤，并按黏液細胞、中間細胞、表皮樣細胞3種細胞的構成比例，將MEC分為低度惡性和高度惡性兩級[29]。隨后有學者結(jié)合其組織病理學特征將MEC劃分為低、中、高三個級別，低等級的MEC是一個低風險的腫瘤，通過手術幾乎可治愈，并且可以忽略淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。常用分級系統(tǒng)有3個:AFIP分級系統(tǒng)[30],Modified Healey分級系統(tǒng)[31]和Brandwein分級系統(tǒng)[32]。而在使用過程中評分系統(tǒng)選擇不同腫瘤級別可能不同，如AFIP系統(tǒng)可能降低腫瘤的等級，通常高級別的MEC是侵襲性腫瘤，需要輔助治療和頸部淋巴結(jié)清掃，而AFIP系統(tǒng)分級可能將具有侵襲性的腫瘤判定為低等級腫瘤，從而增加低等級腫瘤治愈的失敗率[33]。而Brandwein系統(tǒng)可能增加高等級腫瘤患者，導致一些患者接受不必要的輻射或額外的手術。在臨床中治療方式的選擇常根據(jù)腫瘤分級及術前活檢或者術中冰凍活檢來確定，而腫瘤分級方法選擇的不同可能影響到術中手術方式及術后的處理，因此需要更客觀的標志物來對腫瘤進行分級。

在MEC中CRTC1-MAML2融合基因多發(fā)現(xiàn)于低等級的MEC中并提示更高的生存率。Behboudi等[17]報道在CRTC1-MAML2融合陽性和融合陰性的MEC患者的中位生存時間分別是10.0和1.6年，融合陽性MEC患者局部復發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移的風險較融合陰性患者低[24]。Shinomiya等[21]研究在33例MEC病例中發(fā)現(xiàn)23例CRTC1-MAML2基因融合陽性，10例融合陰性，而融合陽性腫瘤的生存率高于融合陰性，并提出融合基因CRTC1-MAML2與TNM分類或臨床分級無關，可為獨立的預后預測因子。Jee等[34]用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應或熒光原位雜交技術檢測28例MEC患者CRTC1、MAML2基因發(fā)現(xiàn)，CRTC1-MAML2基因融合率為64%，其中15種低等級中均存在融合基因，而13個高等級腫瘤中只有3例為陽性。在低等級腫瘤中,表達CRTC1-MAML2融合基因的MEC中沒有或很少基因失衡，并具有良好的預后。而高等級MEC中,融合基因陰性的MEC中存在多個基因失衡，而且預后不佳，并頻繁發(fā)生轉(zhuǎn)移或復發(fā)。因此，MEC中的融合基因代表了腫瘤發(fā)生的一種獨特機制。在此背景下，融合陽性MEC無論級別如何，都表現(xiàn)出更穩(wěn)定的基因組，臨床表現(xiàn)更傾向于良性腫瘤，而融合陰性MEC則表現(xiàn)基因組不穩(wěn)定性和相對侵襲性腫瘤。在MEC中，CRTC1-MAML2的存在可能具有一定的預后價值。

然而，近來也有報道提出融合基因CRTC1-MAML2的表達與腫瘤等級、生存率之間無相關性。Birkeland等[35]報道90例病例中53例融合陽性，其中34例為低等級腫瘤，概率為64%(34/53)，與37例融合陰性病例中24例為低等級，概率為65%(24/37)，融合陽性與融合陰性病例中低等級率差異無統(tǒng)計學意義。認為先前的研究并沒有在生存率評估中控制等級，可能會產(chǎn)生混淆效應。而進一步研究可能影響MECs腫瘤分級和存活的其他基因驅(qū)動因素是有必要的。綜上所述，融合基因可以作為黏膜上皮癌的組織學評分的一個有用的輔助手段，并可能推動新的臨床指導方針的發(fā)展，最終也將用于新的治療策略[36]。

3.3治療應用 MEC最常見的臨床表現(xiàn)類似多形性腺瘤或其他良性腫瘤，呈持續(xù)數(shù)年慢慢擴大的無痛腫塊。低等級惡性腫瘤的特征是緩慢增長的無痛腫脹；高等級腫瘤呈無痛性快速增長，浸潤到鄰近組織，并伴有遠處轉(zhuǎn)移，可能伴發(fā)疼痛或面神經(jīng)麻痹。高等級MEC易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，除淋巴結(jié)外，常見轉(zhuǎn)移部位還有肺、腦和骨。唾液腺腫瘤的主要治療方法是手術切除或結(jié)合術后放射治療。對于出現(xiàn)局部晚期、復發(fā)或轉(zhuǎn)移性疾病的患者，目前治療方案主要是姑息治療。據(jù)報道，MEC低、中、高級別腫瘤的5年總體生存率分別為92%～100%、62%、0%～43%[37]。對于高等級MEC生存率較低，治療方式還很有限，而目前靶向治療越來越成為研究熱點，為MEC治療也提供了新的思路，而CRTC1-MAML2的發(fā)現(xiàn)可能成為靶向治療的目標。目前許多與融合致癌基因相關的腫瘤的靶向治療已經(jīng)取得一定的成效，如酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼治療白血病[38]和克唑替尼治療晚期非小細胞肺癌[39]等。CRTC1-MAML2融合基因在MEC中高表達，基于它在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用，為治療方法提供了一種替代治療方法。目前有研究表明吉非替尼可同時抑制MEC中激活的多種關鍵信號蛋白的磷酸化，其中部分是通過CRTC1-MAML2融合激活的JAK信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子和促分裂原活化的蛋白激酶/促分胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶通路[40]。此外，吉非替尼對EGFR和促分裂原活化的蛋白激酶/胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶通路的抑制作用強于蛋白激酶B、JAK2和信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子，且它們可以解除對CRTC1-MAML2的依賴。體外數(shù)據(jù)也顯示存在染色體易位的MEC細胞系對吉非替尼敏感，其機制可能是通過CRTC1-MAML2上調(diào)EGFR配體的雙向調(diào)節(jié)因子介導的[41]。因此，表達CRTC1-MAML2的MEC是吉非替尼治療的有效靶點。有研究證明肺動脈MEC細胞系對酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼敏感[42]。然而，在MEC中，CRTC1-MAML2融合產(chǎn)物本身并不是一種酶。相反，它與其他蛋白酶、形式轉(zhuǎn)錄、激活復合物相結(jié)合，這些復合物參與調(diào)控通路。因此，治療靶向性并不明確。治療方面目前多關注于對NOTCH的抑制作用。MEC攜帶CRTC1-MAML2易位可能是酪氨酸激酶抑制劑治療的有效靶點。

4 結(jié) 語

CRTC1-MAML2融合基因參與了涎腺MEC的發(fā)生、在MEC腫瘤的生長方面有一定維持作用、并與MEC腫瘤細胞的分化有一定的聯(lián)系，CRTC1-MAML2融合陽性的MEC患者具有較好的預后及生存率。CRTC1-MAML2可作為MEC的特征性基因，輔助MEC的診斷?？蓪RTC1-MAML2融合基因及其蛋白作為目標尋找新的靶向治療，完善MEC的治療方式上的缺陷。但是，目前關于CTTC1-MAML2的研究還有限，研究手段亦較局限，有些研究結(jié)論尚不統(tǒng)一。CRTC1-MAML2基因在與MEC的發(fā)生的具體機制，以及CRTC1-MAML2基因與MEC等級之間是否有關系，是輔助還是獨立的關系，CRTC1-MAML2基因通過哪些信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控MEC的侵襲轉(zhuǎn)移，這些信號轉(zhuǎn)導通路之間的關系如何等一系列問題，都有待于進一步的探索和研究。