呂俊衍，李春媚，魏云華，馬嵐青

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，昆明 650032)

我國是大腸癌高發(fā)國家，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)2015年中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，大腸癌的發(fā)病率和病死率居所有惡性腫瘤前5位，每年大腸癌新發(fā)病例37.6萬，死亡病例19.1萬，已成為嚴(yán)重危害我國國民健康的疾病之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腺瘤性息肉是大腸癌的癌前疾病，約85%的大腸癌源于腺瘤性息肉[2]。目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可的演變過程為正常腸上皮→過度增生上皮→大腸腺瘤→大腸癌，此過程與一系列原癌基因(Kras和C-myc等基因)或抑癌基因[VHL(Von Hippel-Lindau)、APC(adenomatous polyposis coli)、p53等基因]的改變有關(guān)[3-8]。上述基因的改變可導(dǎo)致大腸上皮細(xì)胞過度增殖、分化并發(fā)生異常凋亡改變等，逐漸向惡性增生進(jìn)展。YAP(Yes-associated protein)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核定植后，可作為共轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄因子TEADs(TEA domain family members)結(jié)合，同時(shí)還能協(xié)同β聯(lián)蛋白，以激活與細(xì)胞增殖生長有關(guān)的原癌基因，并抑制凋亡相關(guān)基因，最終影響器官體積大小和腫瘤形成[9-11]。YAP蛋白作為致癌因子，可根據(jù)其在大腸腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平判斷瘤樣新生物的良惡性程度，研究YAP蛋白高表達(dá)癌癥的靶點(diǎn)治療，進(jìn)一步了解大腸癌的發(fā)病機(jī)制，為尋找有效的大腸癌治療方法開拓新的方向?，F(xiàn)就YAP蛋白在大腸新生物發(fā)生、發(fā)展中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 YAP蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

YAP蛋白具有控制正常組織生長和維持器官體積大小的功能。YAP蛋白的功能首先在果蠅體內(nèi)的YAP蛋白同源體Yki上發(fā)現(xiàn)，Yki位于果蠅hpo通路下游，作為共轉(zhuǎn)錄因子與TEAD/TEF家族轉(zhuǎn)錄因子Sd相結(jié)合，控制細(xì)胞凋亡抑制因子果蠅凋亡抑制蛋白1、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CycE等基因轉(zhuǎn)錄，以調(diào)控組織生長和維持器官體積大小，但其過表達(dá)則會(huì)使細(xì)胞增殖加強(qiáng)、凋亡減弱，導(dǎo)致腫瘤形成[12-14]。

Hpo通路及其靶因子Yki蛋白在進(jìn)化中高度保守，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)對(duì)應(yīng)為Hippo通路和YAP蛋白，同時(shí)還存在結(jié)構(gòu)與YAP蛋白相似、發(fā)揮類似功能的蛋白轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ結(jié)合基序[15-16]。YAP蛋白由人類染色體11q13上YAP基因編碼，分子量為65 000，富含無DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的脯氨酸Yes相關(guān)磷蛋白，其上第94位絲氨酸，即S94形成TEAD集合區(qū)，第172～204位和第231～263位氨基酸分別形成2個(gè)WW結(jié)構(gòu)域、1個(gè)SH3結(jié)合基序、1個(gè)coiled-coil結(jié)構(gòu)域、1個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域以及C端的PDZ結(jié)合基序[16-17]。轉(zhuǎn)錄因子，如Runt家族成員多瘤病毒增強(qiáng)子結(jié)合蛋白2、p53蛋白家族成員p73、TEAD/TEF轉(zhuǎn)錄因子家族、Smads家族蛋白、T-box家族成員Tbx5、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族成員Runx2、表皮生長因子受體家族成員第2表皮生長因子受體酪氨酸激酶4等均可與YAP蛋白的各類結(jié)構(gòu)域結(jié)合[18]。

YAP蛋白的5個(gè)保守HXRXXS基序中的絲氨酸可被上游大腫瘤抑制基因1/2直接磷酸化，其中磷酸化后的絲氨酸127位可與蛋白14-3-3結(jié)合，磷酸化后的絲氨酸381位可促進(jìn)酪蛋白激酶1δ/ε進(jìn)一步磷酸化YAP蛋白的其他位點(diǎn)，YAP蛋白可在384位和387位依次被磷酸化后滯留于胞質(zhì)，并招募泛素連接酶的組分β-轉(zhuǎn)導(dǎo)相容蛋白與其結(jié)合，引起YAP蛋白的多泛素化和降解，從而抑制YAP蛋白入核發(fā)揮功能[19-21]。胞質(zhì)的YAP蛋白亦可通過WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合Smads家族蛋白，使其滯留于胞質(zhì)而不能入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用，從而抑制轉(zhuǎn)化生長因子β信號(hào)通路的激活，而未被磷酸化的YAP蛋白則可入核結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄因子來發(fā)揮作用[22-24]。TEAD/TEF是發(fā)揮主要作用的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長因子、膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白2、雙調(diào)蛋白、survivin基因以及許多其他蛋白的基因表達(dá)，使細(xì)胞呈現(xiàn)加速增殖或凋亡抑制的狀態(tài)。同時(shí)，激活的YAP蛋白和TEAD還能直接結(jié)合Lats2基因的啟動(dòng)子，通過磷酸化YAP蛋白和抑制其活性，形成Hippo通路的負(fù)反饋[25]。

有研究表明，介導(dǎo)細(xì)胞接觸和連接的結(jié)構(gòu)及復(fù)合物亦可協(xié)同作用Hippo通路[26]。如作為黏著連接成分用于連接細(xì)胞膜鈣黏素與細(xì)胞骨架actin蛋白的α聯(lián)蛋白可通過其PPXY基序或14-3-3蛋白的介導(dǎo)作用結(jié)合YAP蛋白并抑制其活性[26-28]。黏著分子血管生成抑制素結(jié)合蛋白(angiomotin，AMOT)家族可通過YAP蛋白的WW結(jié)構(gòu)域和自身PPXY基序的相互作用招募YAP蛋白到胞膜緊密連接和actin蛋白處，通過相互結(jié)合使YAP蛋白定位在胞質(zhì)，并激活大腫瘤抑制基因1/2，使YAP蛋白磷酸化，從而阻止其進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮促轉(zhuǎn)錄作用[29-31]。緊密連接蛋白2亦可通過PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合YAP蛋白將其阻滯在細(xì)胞核中，以發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[32-33]。

2 YAP蛋白在腸上皮細(xì)胞更新及大腸腫瘤生成中的作用

YAP蛋白參與腸上皮細(xì)胞的發(fā)育過程，并發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，位于隱窩基底的干細(xì)胞首先遷移到腺腔內(nèi)分化成瞬時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞，再分化成各種成熟的功能性細(xì)胞，并逐漸分布到絨毛中，進(jìn)而遍布整個(gè)小腸表面[8]。內(nèi)源性YAP蛋白多存在于腸道干細(xì)胞定居的腺窩區(qū)，在未分化的腸道細(xì)胞和干細(xì)胞中高表達(dá)，從隱窩基底部到上皮絨毛，其活性逐漸下降且出現(xiàn)核質(zhì)異位[34-35]。腸道細(xì)胞YAP蛋白表達(dá)升高，腸道干細(xì)胞和祖細(xì)胞會(huì)增加，但多呈未分化狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，YAP蛋白活化后第5天的小鼠腸道杯狀細(xì)胞和潘氏細(xì)胞缺失，隨后，人大腸癌標(biāo)本中也發(fā)現(xiàn)了類似YAP蛋白誘導(dǎo)的腸道組織細(xì)胞的發(fā)育異常，表明YAP蛋白的激活可破壞腸上皮細(xì)胞的正常發(fā)育和分化[36]。

大腸息肉的發(fā)展和癌變常伴隨Kras、C-myc、β聯(lián)蛋白等原癌基因的激活[37-38]。激活的YAP蛋白可作為共轉(zhuǎn)錄因子參與Kras、β聯(lián)蛋白、蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路等原癌基因的啟動(dòng)活化，故認(rèn)為YAP蛋白是大腸癌的致癌因子[39-41]。有研究證實(shí)，鋸齒狀腺瘤、家族性結(jié)直腸腺瘤性息肉病患者的結(jié)腸管狀腺瘤和大腸癌組織中均存在YAP蛋白的異常增高和入核定植，但周邊正常上皮組織內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)YAP蛋白的高表達(dá)和入核現(xiàn)象[42-43]。

3 在腸道新生物生成中YAP蛋白與β聯(lián)蛋白的交叉協(xié)同作用

大腸癌多由結(jié)直腸黏膜上皮的良性瘤樣新生物發(fā)展而來，大多數(shù)大腸癌都存在能引起Wnt信號(hào)通路過度活化的突變，其中以引起腫瘤抑制因子APC失活的突變最常見?？梢?，Wnt通路和APC蛋白在大腸新生物發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。

β聯(lián)蛋白是Wnt/β聯(lián)蛋白信號(hào)通路中最重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子。Wnt/β聯(lián)蛋白信號(hào)通路激活時(shí)，β聯(lián)蛋白的磷酸化和降解均被抑制，并在胞質(zhì)不斷積累，后轉(zhuǎn)位入核與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活與細(xì)胞增殖、凋亡及分化有關(guān)的靶基因表達(dá)survivin、C-myc、細(xì)胞周期蛋白D1等蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[44-45]。Wnt/β聯(lián)蛋白信號(hào)通路受APC蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)，其失活可引發(fā)大腸癌。研究發(fā)現(xiàn)，YAP蛋白可與APC和β聯(lián)蛋白相互影響，從而介導(dǎo)Hippo信號(hào)通路與Wnt/β聯(lián)蛋白通路間的相互作用[46-47]。

β聯(lián)蛋白可與YAP蛋白在抗凋亡基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2相關(guān)蛋白1及survivin的啟動(dòng)子形成β聯(lián)蛋白-YAP-Tbx5復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及分化[48]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，YAP基因也是Wnt/β聯(lián)蛋白通路的直接靶基因，β聯(lián)蛋白與YAP基因的啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)節(jié)YAP蛋白表達(dá)，抑制β聯(lián)蛋白表達(dá)可導(dǎo)致YAP蛋白信使RNA水平減少。研究表明，過表達(dá)的YAP蛋白和β聯(lián)蛋白可共同驅(qū)動(dòng)大腸癌細(xì)胞的增殖[49-50]。

研究發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中被Hippo通路磷酸化抑制的YAP蛋白可通過其TEAD結(jié)合區(qū)與β聯(lián)蛋白的N端結(jié)合，使β聯(lián)蛋白滯留在胞質(zhì)，并抑制其活性和入核激活靶基因功能。上游使YAP蛋白磷酸化的哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶1/2的失活可導(dǎo)致Wnt/β聯(lián)蛋白活性增強(qiáng)，進(jìn)一步說明YAP蛋白與β聯(lián)蛋白具有交叉協(xié)同作用[51-52]。

APC作為β聯(lián)蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，亦是人大腸癌中突變率較高的腫瘤抑制因子[53]。在Wnt通路中，APC可抑制YAP基因轉(zhuǎn)錄，APC缺失可致YAP蛋白入核激活YAP-TEAD依賴的轉(zhuǎn)錄，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[46]。在APC突變小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中YAP蛋白被激活，敲除YAP基因后可抑制小腸和結(jié)腸中因APC突變引起的腺癌形成[41]?，F(xiàn)已知APC對(duì)YAP蛋白的抑制調(diào)節(jié)有通過β聯(lián)蛋白形成蛋白復(fù)合體下調(diào)YAP基因表達(dá)和通過聯(lián)合Hippo通路級(jí)聯(lián)磷酸化YAP蛋白兩種機(jī)制[36,54]。

4 YAP蛋白在大腸癌“炎癥-異型增生-腫瘤路徑”的發(fā)生過程中的作用

“炎癥-異型增生-腫瘤路徑”是與經(jīng)典“腺瘤性息肉-癌路徑”不同的大腸癌發(fā)生機(jī)制。有研究表明，腸道干細(xì)胞可在葡聚糖硫酸鈉和博來霉素誘導(dǎo)的損傷中上調(diào)Yki基因的表達(dá)，隨后活化Yki蛋白激活Janus激酶，并協(xié)同細(xì)胞因子Upd產(chǎn)生促細(xì)胞增殖作用，從而闡述Yki基因介導(dǎo)細(xì)胞損傷時(shí)增殖修復(fù)發(fā)生的部分機(jī)制[55-56]。對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下的YAP蛋白缺陷不會(huì)導(dǎo)致明顯的腸上皮缺損，可見YAP蛋白并不是腸道生長發(fā)育過程的必需蛋白；但若對(duì)YAP蛋白缺陷小鼠使用葡聚糖硫酸鈉，則會(huì)造成比YAP蛋白正常表達(dá)小鼠更嚴(yán)重的腸上皮損傷，可見YAP蛋白在腸道黏膜損傷后修復(fù)中起重要作用[43]。在腸道炎癥反應(yīng)(如潰瘍性結(jié)腸炎)中，YAP蛋白作為原癌蛋白在胞質(zhì)內(nèi)濃度上升，并與β聯(lián)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，參與損傷上皮修復(fù)，但過度表達(dá)的YAP蛋白也誘導(dǎo)了息肉結(jié)構(gòu)的形成，經(jīng)免疫組織化學(xué)檢查提示，其結(jié)構(gòu)不同于APC缺陷所形成的息肉，隨著上皮更新修復(fù)的持續(xù)進(jìn)行仍可引起炎癥相關(guān)性腸癌[57]。

5 YAP蛋白在大腸新生物診療中的研究進(jìn)展

5.1YAP蛋白的表達(dá)對(duì)癌組織惡性程度及患者預(yù)后的預(yù)測作用 YAP蛋白可作為生物標(biāo)志物運(yùn)用于臨床。有研究表明，YAP蛋白的表達(dá)量在大腸癌病灶周圍正常組織、大腸腺瘤組織和大腸癌組織中依次遞增，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[58]。手術(shù)切除大腸癌病灶并做淋巴組織清掃后發(fā)現(xiàn)，YAP蛋白表達(dá)量與附屬淋巴結(jié)侵犯情況相關(guān)[59]。由此可見，YAP蛋白的表達(dá)可能提示大腸病變組織的惡性程度及大腸癌患者的預(yù)后。

5.2以YAP蛋白為靶點(diǎn)的癌癥治療進(jìn)展 YAP蛋白有促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，在很多類型的癌癥組織中高表達(dá)，可將YAP蛋白作為藥物靶點(diǎn)應(yīng)用于具有YAP蛋白高表達(dá)的癌癥類型的治療研究。YAP-TEAD復(fù)合物可激活大多數(shù)與YAP蛋白高表達(dá)相關(guān)腫瘤的原癌基因，故可對(duì)兩者的結(jié)合進(jìn)行干擾[60-61]。研究發(fā)現(xiàn)氟芬那酸作為常見的非甾體抗炎藥，可與TEADs的疏水區(qū)結(jié)合，干擾YAP蛋白與TEADs的相互作用，從而抑制與YAP蛋白相關(guān)的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖等[62]。轉(zhuǎn)錄輔助因子退變樣蛋白4的Tondu結(jié)構(gòu)域可與YAP蛋白競爭結(jié)合TEADs，從而抑制YAP蛋白相關(guān)腫瘤的生長，并基于轉(zhuǎn)錄輔助因子退變樣蛋白4與TEADs相互作用原理，設(shè)計(jì)出了一種肽段用于干擾YAP-TEADs復(fù)合物的形成，抑制原發(fā)性胃癌細(xì)胞的生長，從而為YAP蛋白高表達(dá)的腫瘤治療提供新的可能性[63]。經(jīng)高通量篩選發(fā)現(xiàn)，維替泊芬能有效干擾YAP蛋白與TEADs的結(jié)合，并具有抑制YAP蛋白過表達(dá)引起的肝臟生長的作用[60]。

血管生成抑制素結(jié)合蛋白可促進(jìn)YAP蛋白磷酸化，并可通過相互結(jié)合的方式阻止其入核，故可通過加強(qiáng)血管生成抑制素結(jié)合蛋白的作用來抑制YAP蛋白入核。研究顯示，端錨聚合酶類可通過作用E3泛素連接酶RNF146促進(jìn)血管生成抑制素結(jié)合蛋白的降解，故作為端錨聚合酶類抑制因子的XAV939，Wnt反應(yīng)抑制劑1，G007-LK、G244-LM可發(fā)揮抑制血管生成抑制素結(jié)合蛋白降解的作用，從而間接拮抗YAP蛋白活性[64-66]。端錨聚合酶類抑制因子對(duì)YAP蛋白高表達(dá)腫瘤的治療有一定潛力，但具體效果仍需進(jìn)一步研究。

YAP蛋白可通過WW結(jié)構(gòu)域與含有PPXY基序的蛋白結(jié)合，并發(fā)生相互作用[67-68]。研究顯示，WW結(jié)構(gòu)域與WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白2 結(jié)合可增強(qiáng)YAP蛋白的促轉(zhuǎn)錄作用，反之WW結(jié)構(gòu)域的突變可抑制YAP蛋白促進(jìn)原癌基因轉(zhuǎn)錄的作用[69-72]。故可使用能與YAP蛋白WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合的物質(zhì)來抑制其致癌作用。有研究發(fā)現(xiàn)洋地黃可通過結(jié)合于WW結(jié)構(gòu)域的疏水區(qū)來抑制腫瘤細(xì)胞中YAP蛋白的活性[73-75]。但有研究指出，大腫瘤抑制基因1和類血管生成抑制素結(jié)合蛋白1可與YAP蛋白的WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合，對(duì)YAP蛋白進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)，如乳腺上皮細(xì)胞中WW結(jié)構(gòu)域缺陷導(dǎo)致YAP蛋白激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)化，故以WW結(jié)構(gòu)域?yàn)榘悬c(diǎn)治療腫瘤增生，應(yīng)考慮細(xì)胞組織環(huán)境的差異，否則可能激活YAP蛋白[29-30,32]。

6 小 結(jié)

隨著對(duì)Hippo通路組成成分和YAP蛋白在腸上皮炎癥反應(yīng)和異常增生中表達(dá)的不斷研究，YAP蛋白在結(jié)腸新生物生成以及向惡性腫瘤發(fā)展過程中的作用正逐漸被揭示。YAP蛋白作為原癌蛋白可直接上調(diào)增生相關(guān)基因的表達(dá)，亦可與其他涉及細(xì)胞增殖的信號(hào)通路相互作用，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。近年來，通過作用YAP蛋白及其上下游分子抑制YAP蛋白活性，不斷推進(jìn)腫瘤生長變化的研究發(fā)現(xiàn)，抑制大腸癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的YAP蛋白，腫瘤生長可出現(xiàn)不同程度減弱[60-66]。研究發(fā)現(xiàn)隨著大腸新生物惡性程度的升高，細(xì)胞內(nèi)YAP蛋白的表達(dá)量和核定植情況也在上升[58-59]。上述研究在分子層面進(jìn)一步闡釋了大腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，同時(shí)提出了可用于研究大腸癌治療的多個(gè)潛在靶點(diǎn)和預(yù)測腫瘤惡性程度標(biāo)志物。因此，YAP蛋白和大腸腫瘤的關(guān)聯(lián)性研究將為大腸癌的診治提供新的視野。