張霽,吳麗潔,李志元,張丹,智方圓,楊延婷,,吳丹艷,趙越,李茜瑩,馬曉芃,

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隔藥灸對克羅恩病大鼠結(jié)腸NLRP3炎癥小體及IL-1b調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究

張霽1,吳麗潔1,李志元2,張丹3,智方圓1,楊延婷1,3,吳丹艷1,趙越1,李茜瑩1,馬曉芃1,3

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2.浙江省中醫(yī)院,杭州 310006;3.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030)

通過觀察隔藥灸對克羅恩病大鼠結(jié)腸NLRP3炎癥小體(NLRP3、ASC、Caspase-1)及下游炎癥因子IL-1b表達(dá)的影響,探討隔藥灸治療克羅恩病的抗炎機(jī)制。將清潔級雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、隔藥灸組和假灸組4組。采用三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)與乙醇混合溶液灌腸制備大鼠克羅恩病模型。造模成功后,隔藥灸組取天樞(雙)、氣海穴進(jìn)行隔藥餅灸治療;假灸組取穴、操作同隔藥灸組,但不點(diǎn)燃艾炷。治療結(jié)束后,記錄各組大鼠結(jié)腸長度及CMDI評分;采用HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu),并應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測各組大鼠結(jié)腸NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1b的表達(dá)。與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織損傷嚴(yán)重,表現(xiàn)為裂隙樣潰瘍,炎癥細(xì)胞浸潤伴水腫,部分大鼠結(jié)腸黏膜可見肉芽組織形成,且結(jié)腸NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1b蛋白表達(dá)顯著增加(均＜0.05);與模型組比較,隔藥灸組大鼠結(jié)腸損傷有所修復(fù),炎癥反應(yīng)減輕,結(jié)腸NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1b蛋白表達(dá)顯著降低(均＜0.05);假灸組大鼠結(jié)腸損傷程度、炎癥反應(yīng)與模型組類似,兩組結(jié)腸NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1b表達(dá)比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。隔藥灸能下調(diào)克羅恩病大鼠結(jié)腸NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1b的蛋白表達(dá),促進(jìn)結(jié)腸炎性損傷的修復(fù)。

藥餅灸療法;克羅恩病;NLRP3炎癥小體;間接灸;大鼠

克羅恩病(Crohn’s disease, CD)是一種慢性胃腸道炎性肉芽腫性疾病,可發(fā)生于消化道從口腔至肛門的任何部位[1]。臨床癥狀主要包括腹瀉、腹痛、體重減輕、惡心、嘔吐等,在某些情況下可出現(xiàn)發(fā)燒或寒戰(zhàn),多達(dá)1/3的患者患有肛周疾病[2]。此外,研究發(fā)現(xiàn)多種腸外表現(xiàn)與CD相關(guān),如炎癥性關(guān)節(jié)炎、葡萄膜炎和虹膜炎、壞疽性膿皮病以及結(jié)節(jié)性紅斑等[3]。

CD的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前認(rèn)為其發(fā)病為遺傳、免疫和環(huán)境因素等交互作用的結(jié)果[3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3)基因編碼的NLRP3/cryopyrin蛋白是NLRP3炎癥小體的一部分,可與包含CARD結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣接頭蛋白ASC(Apotosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)結(jié)合并招募半胱天冬酶(Caspase-1)使其激活,作為調(diào)控IL-1b、IL-18生成和分泌的平臺,參與包括CD在內(nèi)的多種炎癥性疾病的發(fā)病[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),隔藥灸能下調(diào)CD大鼠結(jié)腸IL-1b的表達(dá),減輕腸道炎癥,改善結(jié)腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)[4-5]。隔藥灸是否通過調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體下調(diào)IL-1b的表達(dá)值得進(jìn)一步研究。因此,本研究擬建立大鼠CD模型,觀察隔藥灸對CD大鼠結(jié)腸NLRP3炎癥小體(NLRP3、ASC、Caspase-1)及下游炎癥因子IL-1b的調(diào)節(jié)作用,基于NLRP3炎癥小體探討隔藥灸治療克羅恩病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠28只,體質(zhì)量為(150±20)g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供[SCXK(滬)2012-0002]。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,溫度為18～26℃,相對濕度為40%～70%,照明12 h晝夜交替,通風(fēng)換氣8～12次/h。飼料和飲用水經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理,大鼠自由攝食、飲水,定期更換墊料。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,觀察其飲食、活動、體態(tài)、背毛等是否健康正常,大鼠無異常后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器

5%(w/v)2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitro- benzenesulfonic-acid, TNBS)(Sigma公司,美國),無水乙醇、戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);NLRP3一抗(Abcam公司,英國),ASC一抗(Abcam公司,英國),Caspase-1一抗(Abcam公司,英國),IL- 1b一抗(Abcam公司,英國);Dako REAL EnVision兔鼠通用二抗檢測試劑盒(Dako,丹麥),組織脫水機(jī)(Leica公司,德國),組織包埋機(jī)(Leica公司,德國),石蠟切片機(jī)(Leica公司,德國),石蠟切片水浴缸(Leica公司,德國),烤片臺(Leica公司,德國)。

1.3 模型制備

參照Morris方法[6],將5%(w/v)的TNBS與50%乙醇按照體積比2:1混合成灌腸液。大鼠稱重后,用超純水配制1%戊巴比妥鈉溶液,按照30 mg/kg劑量腹腔注射麻醉。造模開始前24 h禁食不禁水,使用大鼠灌胃器自肛門插入腸道6～8 cm,以3 mL/kg的劑量灌入上述灌腸液,灌腸后保持大鼠倒立位60 s,每7 d進(jìn)行1次,持續(xù)4周。于造模結(jié)束時,每組隨機(jī)取1只大鼠處死,取其結(jié)腸組織做HE染色以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒εc否。在驗(yàn)證模型制備成功的基礎(chǔ)上,進(jìn)行干預(yù)。

1.4 分組與治療

正常組不進(jìn)行任何處理與治療。

模型組在模型制備成功后,不進(jìn)行任何治療,只作與隔藥灸組相同的抓取和固定。

隔藥灸組選取天樞(雙)、氣海穴,進(jìn)行隔藥灸治療,每次每穴各灸2壯(約10 min)。每日1次,共治療7次。藥餅主要成份為附子粉,灸前用黃酒調(diào)和,并用動物專用模具制成藥餅;用模具將艾絨壓實(shí)制成錐形艾炷,艾炷重量為90 mg,置于藥餅上,點(diǎn)燃艾炷施灸。

假灸組僅做與隔藥灸組相同的固定,并將艾炷及藥餅置于大鼠腹部天樞(雙)、氣海穴上,但不點(diǎn)燃艾炷,每次10 min。每日1次,共7次。

1.5 樣本采集與處理

治療結(jié)束后,各組大鼠禁食、不禁水24 h,用1%戊巴比妥鈉,按照30 mg/kg劑量腹腔注射麻醉,腹主動脈取血。沿大鼠腹正中線剪開腹部皮膚,充分暴露直腸、結(jié)腸部分,自恥骨聯(lián)合處至盲腸取下大鼠整個結(jié)腸,并測量結(jié)腸長度并記錄數(shù)據(jù)后,沿腸系膜縱軸剖開,取肛門起向上5～8 cm部分,用4℃冷生理鹽水沖洗,取下結(jié)腸段放入4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定24 h。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 結(jié)腸長度

測量各大鼠結(jié)腸長度,并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6.2 結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)(colon macroscopic damage index, CMDI)

對各組大鼠結(jié)腸進(jìn)行結(jié)腸大體損傷評分,該評分包括結(jié)腸及周圍組織的黏連程度、潰瘍及炎癥損傷的嚴(yán)重程度。無黏連為0分;輕度黏連(結(jié)腸與其他組織剝離較易)為1分;重度黏連為2分。無潰瘍及炎癥為0分;局部充血無潰瘍?yōu)?分;1處潰瘍不伴出血和腸壁增厚為2分;1處潰瘍伴炎癥為3分;2處潰瘍伴炎癥為4分;＞2處潰瘍伴炎癥或炎癥面積＞1 cm為5分;潰瘍和(或)炎癥面積2 cm隨病變范圍每增加1 cm,積分增加1分(6～8分)。根據(jù)以上評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分,并分析統(tǒng)計[7]。

1.6.3 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察

采用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)對組織切片進(jìn)行染色,光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化。HE染色主要步驟如下,①常規(guī)脫蠟水化,切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中脫蠟各20 min,梯度乙醇100%、90%、80%、70%各3 min。②雙蒸水沖洗。③核染色,用蘇木素染色約2.5 min后,放入自來水中緩緩沖洗10 min;1%鹽酸乙醇分化2 s,再流水緩緩沖洗 5 min反藍(lán)。④伊紅胞質(zhì)染色,將切片放入0.1%伊紅中染色10 min后,依次經(jīng)過梯度乙醇70%、80%各1 min, 90%、100%各3 min,根據(jù)鏡下顯色調(diào)整時間。⑤透明,將切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min后,擦去多余液體,中性樹膠封片。

1.6.4 結(jié)腸組織NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1b蛋白表達(dá)檢測

采用免疫組織化學(xué)Envision法檢測。主要步驟如下,①結(jié)腸組織石蠟切片(4mm)于60℃恒溫烤箱中烤片1.5 h。②脫蠟水化,將切片浸于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各10 min,梯度乙醇100%、90%、80%、70%各3 min,PBS沖洗3 min×3次。③抗原修復(fù),將切片置于600 mL檸檬酸鹽緩沖液中,微波中高火沸騰后,取出室溫冷卻10 min,再沸騰8 s,于室溫自然冷卻1 h。④消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,將組織切片浸于3%的H2O2中,避光孵育25 min后,雙蒸水沖洗3 min×3次。⑤玻片擦干,用5%BSA封閉液封閉,室溫孵育20 min,甩去多余液體,滴加一抗,4℃冰箱過夜。37℃恒溫烤箱復(fù)溫45 min, PBS沖洗3 min×3次。滴加A液,室溫孵育30 min后,PBS沖洗3 min×3次。擦干,滴加DAB工作液(10mL C液:990mL B液),光鏡下控制顯色,顯色完全后,濕盒中止顯色1 min。蘇木素染色2.5 min,自來水沖洗10 min。⑥1%鹽酸乙醇分化1～3 s,自來水沖洗5 min反藍(lán)。⑦梯度乙醇脫水70%、80%、90%、100%各3 min。⑧二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min透明。⑨封片(中性樹膠:二甲苯＝1:1.5)。⑩數(shù)據(jù)采集,每張切片隨機(jī)選取5個視野拍攝照片,通過Image-pro plus 6.0軟件進(jìn)行半定量分析,取陽性目標(biāo)的積分光密度進(jìn)行統(tǒng)計。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。對所有計量資料進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。當(dāng)計量資料符合正態(tài)分布時采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;當(dāng)計量資料呈偏態(tài)分布時采用中位數(shù)(最小值,最大值)的形式表示。若計量資料服從正態(tài)分布,且數(shù)據(jù)符合方差齊性檢驗(yàn),組間差異采用單因素方差分析(),兩兩比較用最小顯著差法(,),方差不齊時用比較組間差異。若計量資料不服從正態(tài)分布,則用秩和檢驗(yàn)。以＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸長度的變化

與正常組比較,模型組、隔藥灸組、假灸組大鼠結(jié)腸長度均縮短,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。與模型組比較,隔藥灸組大鼠結(jié)腸長度雖有增加趨勢,但兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。而假灸組大鼠結(jié)腸長度與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸長度比較 (±s,cm)

注:與正常組比較1)＜0.05

2.2 大鼠CMDI的變化(表2)

表2 各組大鼠CMDI比較 (±s,分)

注:與正常組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.01

與正常組比較,模型組、假灸組大鼠CMDI升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。與模型組比較,隔藥灸組大鼠CMDI明顯降低,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01),假灸組大鼠CMDI與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。詳見表2。

2.3 大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化

光學(xué)顯微鏡下觀察,正常組大鼠結(jié)腸黏膜層上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,固有層杯狀細(xì)胞、腺體排列整齊有序;黏膜下層疏松結(jié)締組織形態(tài)完整;腸壁肌層(內(nèi)環(huán)、外縱)結(jié)構(gòu)完整無增生,漿膜層分布清晰。模型組大鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)明顯,局部黏膜表面有糜爛甚至潰瘍形成,潰瘍呈裂隙狀,局部杯狀細(xì)胞增生明顯,腺體破壞、腺腔排列紊亂;黏膜下層結(jié)締組織嚴(yán)重水腫伴炎癥細(xì)胞浸潤,大量纖維組織增生;腸壁肌層、漿膜層分布尚清晰,病理變化較接近克羅恩病。隔藥灸組大鼠結(jié)腸黏膜層結(jié)構(gòu)尚完整,損傷處可見上皮組織修復(fù),杯狀細(xì)胞及腺體修復(fù)較好,腺體排列尚規(guī)則;黏膜固有層及黏膜下層可見炎癥細(xì)胞浸潤,黏膜下層結(jié)締組織中度水腫;結(jié)腸肌層、漿膜層形態(tài)結(jié)構(gòu)完整。假灸組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn)與模型組類似。結(jié)果提示,隔藥灸對克羅恩模型大鼠結(jié)腸炎癥損傷具有一定的改善作用。詳見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果(×200)

2.4 大鼠結(jié)腸NLRP3蛋白表達(dá)的變化(表3)

表3 各組結(jié)腸NLRP3蛋白表達(dá)結(jié)果比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01; 與假灸組比較3)＜0.05

與正常組比較,模型組、假灸組大鼠結(jié)腸NLRP3蛋白表達(dá)明顯增高(均＜0.01);與模型組比較,隔藥灸組大鼠結(jié)腸NLRP3蛋白表達(dá)明顯減少(＜0.01),而假灸組大鼠結(jié)腸NLRP3蛋白表達(dá)則無顯著性變化 (＞0.05)。與假灸組比較,隔藥灸組大鼠結(jié)腸NLRP3蛋白表達(dá)明顯降低(＜0.05)。詳見表3、圖2。

2.5 大鼠結(jié)腸ASC蛋白表達(dá)的變化

與正常組比較,模型組、假灸組大鼠結(jié)腸ASC蛋白表達(dá)明顯增高(均＜0.01);與模型組比較,隔藥灸組大鼠結(jié)腸ASC蛋白表達(dá)顯著下降(＜0.01),假灸組大鼠結(jié)腸ASC表達(dá)無顯著性變化(＞0.05);與假灸組比較,隔藥灸組大鼠結(jié)腸ASC表達(dá)明顯降低(＜0.01)。詳見表4、圖3。

表4 各組大鼠結(jié)腸ASC表達(dá)結(jié)果比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01; 與假灸組比較3)＜0.01

2.6 大鼠結(jié)腸Caspase-1蛋白表達(dá)的變化

與正常組比較,模型組、假灸組大鼠結(jié)腸Caspase-1蛋白表達(dá)明顯增高(均＜0.05);與模型組比較,隔藥灸組大鼠結(jié)腸Caspase-1蛋白表達(dá)明顯降低(＜0.01),假灸組大鼠結(jié)腸Caspase-1表達(dá)無顯著性變化(＞0.05);與假灸組比較,隔藥灸組大鼠結(jié)腸Caspase-1蛋白表達(dá)明顯降低(＜0.01)。詳見表5、圖4。

表5 各組結(jié)腸Caspase-1表達(dá)結(jié)果比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01; 與假灸組比較3)＜0.01

2.7 大鼠結(jié)腸IL-1b蛋白表達(dá)的變化

與正常組比較,模型組、假灸組大鼠結(jié)腸IL-1b蛋白表達(dá)明顯增高(均＜0.05);與模型組比較,隔藥灸組大鼠結(jié)腸IL-1b蛋白表達(dá)明顯降低(＜0.05),假灸組大鼠結(jié)腸IL-1b蛋白表達(dá)無顯著變化(＞0.05);與假灸組比較,隔藥灸組大鼠結(jié)腸IL-1b蛋白表達(dá)明顯降低(＜0.01)。詳見表6、圖5。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織NLRP3的免疫組化(×200)

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織ASC表達(dá)的免疫組化(×200)

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織Caspase-1的免疫組化(×200)

圖5 各組大鼠結(jié)腸組織IL-1β的免疫組化(×200)

表6 各組大鼠結(jié)腸IL-1b表達(dá)結(jié)果比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01; 與假灸組比較3)＜0.01

3 討論

克羅恩病是一種慢性、復(fù)發(fā)性疾病,組織活檢可見肉芽腫性透壁性炎癥,可累及消化道任何部分,但最常見于末端回腸和鄰近結(jié)腸,呈不連續(xù)性、節(jié)段性病位分布,目前臨床上尚未有治愈手段,部分患者選擇外科手術(shù)切除治療[8]。重癥CD患者遷延難愈,預(yù)后不良,是公認(rèn)的引發(fā)結(jié)腸腫瘤的因素[9]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示,不同種族間CD的發(fā)病率差異顯著,1項(xiàng)基于人群的系統(tǒng)評價研究顯示,CD發(fā)病率最高的是歐洲(德國CD患病率為322/10萬),北美次之(美國CD發(fā)病率為319/10萬)。其中22項(xiàng)關(guān)于CD的研究中有16項(xiàng)(72.7%)研究顯示北美和歐洲CD的發(fā)病率呈穩(wěn)定或下降趨勢;而自1990年以來,非洲、亞洲和南美洲的新興工業(yè)化國家(包括巴西)的CD發(fā)病率一直呈上升趨勢[10];近年來我國CD的發(fā)病率逐年上升,如今已成為國內(nèi)消化科的常見病[11]。由于其復(fù)發(fā)緩解過程會對不同年齡患者(尤其是年輕人)的生活質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響,且尚未有有效治愈該疾病的藥物,故有30%～50%的炎癥性腸病患者選擇常規(guī)治療外的其他療法作為緩解手段[12-13]。而且隨著病程的進(jìn)展,腸纖維化、炎癥等會導(dǎo)致腸狹窄,最終會出現(xiàn)梗阻癥狀。盡管近年來對CD的研究取得了一定進(jìn)展,抗炎等治療顯著改善了患者臨床癥狀,但現(xiàn)有的治療仍無法改善患者的腸纖維化甚至狹窄[14]。因此,探尋CD的有效治療方法一直是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。

研究顯示,在CD發(fā)病過程中固有免疫系統(tǒng)發(fā)揮關(guān)鍵作用,腸黏膜固有免疫系統(tǒng)主要由腸道黏膜屏障、固有免疫細(xì)胞及其產(chǎn)物組成[15]。黏膜屏障一旦受損則細(xì)菌及其產(chǎn)物入侵黏膜下層,與初始免疫細(xì)胞和過繼免疫細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng),釋放促炎因子(TNF-a、IL-1、IL-6、ROS等)放大炎癥反應(yīng)。NLRP3是一種存在于胞質(zhì)內(nèi)的模式識別受體,在識別特異性的病原相關(guān)分子模式后,將信號傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞,激活細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB,進(jìn)入細(xì)胞核后啟動一系列相關(guān)炎癥因子轉(zhuǎn)錄及炎癥小體裝配的級聯(lián)反應(yīng)。其中核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域受體(NLRs/ALRs)被激活并招募胞質(zhì)中的相關(guān)蛋白形成復(fù)合體即炎癥小體(inflammasome),炎癥小體的裝配可激活pro-Caspases-1和Caspases-11,將酶原形式的Caspase快速轉(zhuǎn)化為活性蛋白酶,切割前體pro- IL-1b、pro-IL-18為成熟的炎癥因子并分泌成熟的IL-1b、IL-18[16]。NLRP3炎癥小體的激活失控,則會產(chǎn)生過量IL-1b、IL-18或其他炎性因子,進(jìn)而誘導(dǎo)大量炎性介質(zhì)、炎性細(xì)胞等在患處堆積,導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重炎癥并誘發(fā)壞死及損傷。CD發(fā)病時,腸黏膜被腸道中各種刺激因子刺激,導(dǎo)致NLRP3炎癥小體激活,隨之IL-1b等表達(dá)增多,并造成局部黏膜損傷[17-18]。

另外,有研究發(fā)現(xiàn)CD的易感性與NLRP3炎癥小體和NOD2的異常激活相關(guān)[19]。隨著炎癥小體與CD的相關(guān)性研究的深入,發(fā)現(xiàn)NLRP3基因編碼區(qū)(先前為NALP3)和CARD8基因(編碼CARD蛋白)中的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與CD的易感性有關(guān)[20]。一項(xiàng)研究對來自CD家族的710個樣本組合進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)NLRP3基因調(diào)節(jié)區(qū)中的3個SNP與CD具有相關(guān)性[21]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),納入研究的25名CD患者中有60%的患者檢測到NLRP3炎癥小體激活,而潰瘍性結(jié)腸炎患者與對照組相比較NLRP3炎癥小體的激活差異無統(tǒng)計學(xué)意義[18]。以上研究提示,NLRP3炎癥小體的激活與CD發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,深入研究NLRP3炎癥小體與CD之間的關(guān)系,有助于進(jìn)一步揭示CD的發(fā)病機(jī)制。

中醫(yī)學(xué)中無CD的專屬名詞,依據(jù)其癥狀常被歸類為“泄瀉”“腹痛”等范疇。艾灸是中醫(yī)學(xué)重要的組成部分,具有調(diào)整陰陽、扶正祛邪、疏通經(jīng)絡(luò)等作用。作為中醫(yī)學(xué)治療腸腑疾病的有效療法,艾灸近年來在炎癥性腸病的臨床治療中漸漸被廣泛應(yīng)用,對于輕、中度CD患者的療效較為明顯[22-24]。大量臨床與動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也證實(shí),艾灸治療炎癥性腸病可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)通路、炎性因子水平、基因表達(dá)等,起到降低炎癥反應(yīng)、修復(fù)結(jié)腸黏膜屏障、減少組織纖維化、減輕內(nèi)臟痛、緩解焦慮情緒等作用[5,25]。

本研究結(jié)果顯示,CD模型大鼠結(jié)腸組織的NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1b蛋白表達(dá)均顯著升高。Du X等[26]通過TNBS誘導(dǎo)SD大鼠結(jié)腸炎模型,模型組大鼠結(jié)腸NLRP3、IL-1b表達(dá)亦顯著升高。Castro J等[27]通過TNBS誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎模型,并采用RT-PCR檢測結(jié)腸NLRP3、IL-1bmRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)兩者在模型組結(jié)腸組織中的表達(dá)均顯著上升。Bauer C等[28]使用DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎模型,發(fā)現(xiàn)NLRP3基因缺陷型(NLRP3-/-)小鼠與野生型小鼠相比較,結(jié)腸損傷極大程度降低; NLRP3炎癥小體及IL-1b的表達(dá)顯著上升,且IL-1b的表達(dá)依賴NLRP3炎癥小體激活。以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果均有一致性,提示CD模型NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子IL-1b蛋白的表達(dá)異常增高。本研究在隔藥灸治療后,CD大鼠結(jié)腸組織病理損傷顯著改善,黏膜層上皮、杯狀細(xì)胞及腺體得到一定程度的修復(fù),炎癥反應(yīng)減輕;結(jié)腸組織中NLRP3炎癥小體(NLRP3、ASC、Caspase-1)及其下游炎癥因子IL-1b蛋白的表達(dá)水平降低。IL-1b是NLRP3炎癥小體信號通路下游重要的炎癥因子,與腸道炎癥相關(guān),已有研究證實(shí)IL-1b是引發(fā)腸道炎癥最重要的致炎因子之一,可導(dǎo)致腸道屏障功能障礙,誘發(fā)并擴(kuò)大炎癥反應(yīng)等[29-32]。因此,推測隔藥灸可能通過抑制CD大鼠結(jié)腸NLRP3炎癥小體的異常激活,進(jìn)而下調(diào)結(jié)腸炎癥因子IL-1b蛋白的表達(dá),達(dá)到促進(jìn)結(jié)腸炎性損傷修復(fù)之目的。

炎癥小體的發(fā)現(xiàn)為CD發(fā)病機(jī)制以及艾灸抗炎機(jī)制的研究提供了新的視角。闡明炎癥小體活化及其調(diào)控CD炎癥反應(yīng)的確切分子機(jī)制,對于CD的防治具有重要意義,并有望成為治療CD的新靶點(diǎn)。通過研究NLRP3炎癥小體上下游信號通路與CD發(fā)病的關(guān)系以及艾灸對其的調(diào)控作用,將有助于進(jìn)一步提高CD的臨床療效。

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Experimental Study on the Regulating Effect of Herbal Cake-partitioned Moxibustion on NLRP3 Inflammasome and IL-1β in Colons of Crohn's Disease Rats

1,1,2,3,1,1,3,1,1,1,1,3.

1.,201203,; 2.,310006,;3.,200030,

To explore the action mechanism of moxibustion in treating Crohn's disease (CD) by observing the effect of herbal cake-partitioned moxibustion on the expression of NLRP3 inflammasome (NLRP3, ASC and Caspase-1) and IL-1β.Male Sprague Dawley (SD) rats of clean conventional grade were randomized into a normal control group (NG), a model control group (MG), a herbal cake-partitioned moxibustion control group (MoxG), and a sham moxibustion control group (SMG). The CD rat models were developed by using the mixture of 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) and alcohol via enema. When the models were successfully developed, the MoxG received moxibustion intervention at bilateral Tianshu (ST25) and Qihai (CV6), and the SMG were administered by unlighted moxa cones. At the end of treatment, the length of each rats' colon and the colon macroscopic damage index (CMDI) score were recorded, the histopathological variations of rats' colons were observed by adopting HE staining and light microscope, and the expressions of NLRP3, ASC, Caspase-1 and IL-1β in rats' colons were determined by using immunohistochemical technique.Compared to the NG, the MG had its rats' colons present with severe damages, fissured ulcers and inflammatory cell infiltration with edema, and granulomas in submucosa of some colons, and its expressions of NLRP3, ASC, Caspase-1 and IL-1β increased significantly (＜0.05); compared to the MG, the MoxG had rats' colons present with improved structures and reduced intestinal inflammation, and its expressions of NLRP3, ASC, Caspase-1 and IL-1β dropped significantly (＜0.05); the SMG had its rats' colon inflammation present similarly to the MG, and its expressions of NLRP3, ASC, Caspase-1 and IL-1β had no significant difference (＞0.05).Herbal Cake-partitioned moxibustion can down-regulate the expressions of NLRP3, ASC, caspase-1 and IL-1β in CD rats' colons to promote the repair of colon damage.

Medicinal cake-partitioned moxibustion; Crohn’s disease; NLRP3 inflammasome; Indirect moxibustion; Rats

1005-0957(2019)02-0119-08

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.02.0119

2018-08-03

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2015CB554501);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81674073);上海市衛(wèi)生計生系統(tǒng)優(yōu)秀學(xué)科帶頭人培養(yǎng)計劃項(xiàng)目(2017BR047)

張霽(1990—),女,2016級博士生,Email:zhangdaimao1990@163.com

吳麗潔(1990—),女,2017級博士生,Email:wljzwb@163.com

馬曉芃(1973—),女,研究員,博士生導(dǎo)師,Email:pengpengma@163.com