管曉波, 徐靜文, 劉 群, 童艷晨, 陸 崢, 劉 飛

(1. 上海市民政第三精神衛(wèi)生中心康復(fù)三病區(qū), 上海 200435； 2. 上海市民政第三精神衛(wèi)生中心醫(yī)務(wù)科, 上海 200435；3. 上海市民政第三精神衛(wèi)生中心治療病區(qū), 上海 200435； 4. 同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院臨床精神科, 上海 200065)

精神分裂癥是一種嚴(yán)重的衰退性疾病，通常需要長期甚至終生使用抗精神病藥物治療。抗精神病藥誘發(fā)的體質(zhì)量增加(antipsychotic-induced weight gain, AIWG)是抗精神病藥物的常見不良反應(yīng)，是患者治療依從性差的主要原因之一，且增加發(fā)生2型糖尿病、代謝綜合征和心血管事件的風(fēng)險[1-3]。各種抗精神病藥物導(dǎo)致的AIWG嚴(yán)重程度各有不同，其中以氯氮平和奧氮平誘發(fā)AIWG尤為突出。第二代抗精神病藥(second generation antipsychotics, SGA)奧氮平通過作用于控制能量平衡的下丘腦，增加進食刺激，繼而導(dǎo)致體質(zhì)量增加、代謝紊亂及高血糖風(fēng)險[4-5]。除了藥物不良反應(yīng)，導(dǎo)致精神分裂癥患者發(fā)生肥胖的原因還包括不良生活方式、社會心理因素和基因缺陷等。

隨著SGA相關(guān)體質(zhì)量增加的藥物遺傳學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，人們致力尋找明確的候選基因以便指導(dǎo)臨床選擇避免肥胖的藥物。黑素皮質(zhì)素受體-4基因(melanocortin four receptor, MC4R)屬于一個包含7個跨膜結(jié)構(gòu)域的G-蛋白偶聯(lián)受體家(G-protein-coupled receptors, GPCR)，這個基因家族在下丘腦神經(jīng)核群調(diào)整攝食區(qū)域有較低水平的表達[6]。動物實驗證實缺乏MC4R等位基因r(MC4R-/-)的大鼠會產(chǎn)生肥胖癥狀，而雜合子基因鼠(MC4R+/-)出現(xiàn)中度肥胖的表型[7]。全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide assoeiationstudy, GWAS)發(fā)現(xiàn)MC4R附近的單核苷酸多態(tài)性位點rs489693與SGA肥胖相關(guān)基因位點，該基因位點多態(tài)性導(dǎo)致體質(zhì)量增加具有遺傳生物學(xué)合理性[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)初次服用SGA的高加索人種精神分裂癥患者群體中，rs489693多態(tài)性含A等位基因可能是發(fā)生體質(zhì)量增加的風(fēng)險因素[9]。但目前尚缺乏漢族慢性精神分裂癥患者服用奧氮平治療后體質(zhì)量變化與rs489693多態(tài)性的關(guān)系。本研究選取上海地區(qū)漢族的慢性精神分裂癥患者，根據(jù)不同MC4R rs489693多態(tài)性及服用奧氮平治療后體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、糖脂水平和尿酸變化的情況，從遺傳學(xué)角度分析探討該位點與精神分裂癥患者發(fā)生肥胖風(fēng)險的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

納入2018年1月1日至2018年01月31日在上海市民政第三精神衛(wèi)生中心門診或住院的非急性期精神分裂癥住院患者共135例。入組標(biāo)準(zhǔn)： (1) 年齡18～65歲，漢族，男女不限；(2) 符合國際精神與行為障礙分類第十版(ICD-10)精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn),病程大于2年；(3) 入組前已經(jīng)服抗精神病藥者需停止服用抗精神病藥物，藥物清洗期2周；(4) 文化、社會及受教育背景足以理解知情同意和研究內(nèi)容。排除標(biāo)準(zhǔn)： (1) 合并符合ICD-10除精神分裂癥以外的診斷；(2) 有腦器質(zhì)性疾病或嚴(yán)重的頭部外傷史；(3) 過去2個月有存在酒精或其他物質(zhì)依賴或濫用者，社會和認(rèn)知功能顯著缺損；(4) 在過去1年中，有喪偶等重大生活事件；(5) 嚴(yán)重自殺企圖者；(6) 當(dāng)前患者嚴(yán)重的軀體疾病如顯著心血管功能、肝腎功能異常等；(7) 孕 婦和哺乳期女性；(8) 近1個月接受過MECT治療者。本研究通過上海市民政第三精神衛(wèi)生中心倫理委員會一致同意(滬三精發(fā)[2018]26號)。所有受試者及其法定監(jiān)護人均進行知情同意相關(guān)告知，理解試驗?zāi)康暮瓦^程，收益及可能的不良反應(yīng)，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 MC4R基因型檢測 對于入組患者首先予藥物代謝基因檢測(MC4R)。所有研究對象于早上6：00 取樣，利用口腔拭子采集口腔黏膜脫落細胞，并委托上海康黎醫(yī)學(xué)檢驗所進行DNA的提取和多態(tài)性的檢測。DNA提取完成之后，采用PCR及飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(matrix assisted laser desorption ionization time of flight, MALDI-TOF)對MC4R(rs489693)多態(tài)性分析。主要步驟如下： (1) PCR擴增反應(yīng)： 反應(yīng)體系為基因組DNA10ng,引物0.1mol/L,緩沖液0.5μL，MgCl22mmol/L，dNTP 500mol/L,Taq酶1U，體系共5μL。SNP位點的上游引物為： 5′-CCAGATTTGGTCAATACAGG-3′，下游引物為： 5′-TATGGACGGTGCGACATTTG-3′(搜索自https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?do_not_redirect&rs=rs489693)。擴增條件為95℃預(yù)變性2min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，進行45次循環(huán)，最后72℃延伸5min，4℃ 保存。(2) 蝦堿性磷酸酶反應(yīng)(shrimpal-kalinephosphatase, SAP)： SAP消化PCR擴增后剩余的dNTP及殘留引物。(3) 單堿基延伸反應(yīng)： 反應(yīng)體系為純化后PCR產(chǎn)物7μL，iPLEX緩沖液0.2μL，iPLEX特異性終止反應(yīng)液0.2μL，延伸引物0.94μL，iPLEX酶0.041μL，體系共9μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性30s；94℃變性5s，52℃退火5s，80℃ 延伸5s，共進行40次循環(huán)(其中52℃退火5s及80℃延伸5s進行5次循環(huán))；最后72℃延伸3min。(4) 樣本脫鹽及上機檢測： 將上一步的反應(yīng)產(chǎn)物加入陽離子交換樹脂完成脫鹽，點樣，利用質(zhì)譜儀進行分析，并使用Typer Analyzer軟件分析基因分型數(shù)據(jù)。根據(jù)不同MC4R基因rs489693多態(tài)性分為AA型，AC型，CC型3組。

1.2.2 一般資料和人口學(xué)資料收集 使用研究者自編的一般情況問卷： 用于收集患者姓名、性別、年齡、民族、婚姻、教育年限、文化程度等一般人口學(xué)資料以及身高、體質(zhì)量、腰圍、病程、家族史、婚姻史、吸煙史等疾病相關(guān)資料，計算BMI=體質(zhì)量/身高2。

1.2.3 陽性與陰性癥狀量表(PANSS量表)[10-11]評分 用于評定精神病性癥狀的嚴(yán)重程度，經(jīng)過30余年的臨床和科研使用，被證明具有良好的信度和效度，兼顧了精神分裂癥的陽性癥狀和陰性癥狀及一般精神病理癥狀，較全面地反映了精神病理全貌。本研究使用的是何燕玲等[12]于20世紀(jì)90年代引入國內(nèi)的PANSS中文版，共30個基本條目組成3個分項： 陽性、陰性和一般精神病理。每個條目均為7級評分，從1到7，按精神病理水平遞增排列[13]。

1.2.4 實驗室檢查 所有研究對象于早晨6：00抽血取樣，全自動生化分析儀(7180，HITACHI，日本)檢測空腹血脂譜，包括總膽固醇(total cholesterol, TC)、三酰甘油(triacylglycerol, TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)，檢查血糖、糖化血紅蛋白、尿酸水平。

1.3 治療與評估

所有研究對象予奧氮平口服治療，共服用12周。復(fù)發(fā)者治療前需停止服用任何抗精神病藥物，藥物清洗期2周。奧氮平片的用藥方案為10～20mg/d。PANSS量表由2名專門受過培訓(xùn)的主治醫(yī)師完成，Kappa值為0.84。評估時點： 分別于基線、治療4周末、8周末、12周末對研究對象行PANSS量表測試。所有被試者均在寬敞安靜的環(huán)境下完成測驗。所有研究對象于基線和治療12周末行體質(zhì)量、腰圍和實驗室檢查，見圖1。

圖1 研究路線圖Fig.1 Research roadmap

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

本研究基線納入符合入組條件的慢性精神分裂癥門診或住院患者135例，有15例排除(3例基因檢測無結(jié)果，3例缺乏生化數(shù)據(jù)，2例門診失訪，7例轉(zhuǎn)院)，故最終120例納入研究統(tǒng)計。根據(jù)DNA測序法檢測MC4R基因rs489693的多態(tài)性分為AA組19例(15.83%)，AC組46例(38.33%)，CC組55例(45.83%)，其中男性85例(70.83%)，女性35例(29.17%)。A等位基因在男性總數(shù)為56，女性總數(shù)為28，C等位基因在男性總數(shù)為114，女性總數(shù)為42，OR值為0.737(95%CI為0.415～1.310)。平均年齡(62.51±9.14)歲，3組在性別、年齡、病程、家族史、婚姻史、吸煙史方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(卡方檢驗或方差分析，P>0.05)。本研究3組奧氮平使用劑量采用Kruskal-Wallis檢驗，結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。rs489693基因分布頻率符合Hardy- Weinberg平衡檢驗(χ2=2.98，P=0.08)。

表1 不同基因型組變量的一般資料分析

3組間比較計數(shù)資料采用卡方分析或Fisher精確檢驗，計量資料采用的是方差分析；不服從正態(tài)分布采用Kruskal-Wallis檢驗，*P<0.05，**P<0.01

2.2 PANSS量表評分分析

經(jīng)12周治療后，所有120例研究對象的PANSS總分、陽性得分、陰性得分均趨下降趨勢(平均減分13.84±12.14、6.12±1.96、4.10±2.28)，見圖2。3組間經(jīng)重復(fù)測量方差分析，AA組、AC組、CC組的PANSS總分、陽性分、陰性分、一般病理分存在時間主效應(yīng)(P均<0.01)，提示各項分?jǐn)?shù)治療后比基線顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。AA組、AC組、CC組在PANSS各項的分組主效應(yīng)、時間×分組交互效應(yīng)經(jīng)檢驗，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表2。

圖2 PANSS減分示意圖Fig.2 Score deduction diagram of PANSS

表2 PANSS量表的重復(fù)測量方差分析

**P<0.01

2.3 體質(zhì)量、腰圍、BMI變量的分析

治療12周后，以年齡、性別、病程為協(xié)變量，對治療前后患者的體質(zhì)量、腰圍、BMI等項目進行協(xié)方差分析發(fā)現(xiàn)3組在治療后凈增體質(zhì)量、凈增BMI、凈增BMI百分比有差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。余項3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表3。為進一步觀察3組間的差異使用Bonferroni校正法進行事后兩兩比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)凈增體質(zhì)量AA組大于AC組(P=0.017)和CC組(P<0.01)；凈增BMI AA組大于AC組(P=0.031)和CC組(P<0.01)，凈增BMI百分比AA組大于CC組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 糖脂水平和尿酸的分析

治療12周后，以年齡、性別、病程為協(xié)變量，對治療前后患者的糖脂水平和尿酸等項目進行協(xié)方差分析發(fā)現(xiàn)，3組在治療后血糖、治療后糖化血紅蛋白有差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。余項3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表4。使用Bonferroni校正法進行事后兩兩比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療后血糖AA組大于CC組(P=0.040)；治療后糖化血紅蛋白AA組大于CC組(P=0.026)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 不同基因型組體質(zhì)量、腰圍、BMI變量的協(xié)方差分析

觀察變量AA組(n=19)AC組(n=46)CC組(n=55)FP體質(zhì)量/kg 基線62.42±9.5560.83±10.7160.27±11.060.2340.792 治療后68.42±10.0164.37±11.0162.53±11.111.8810.157 凈增6.00±4.513.54±3.742.25±2.828.3870.000??腰圍/cm 基線92.63±9.2591.48±10.6291.84±10.700.1410.868 治療后96.42±10.3494.61±10.0293.89±9.980.4050.668 凈增3.79±4.333.13±4.882.05±4.690.7630.468BMI/(kg·m-2) 基線22.37±3.2322.52±3.2321.98±3.640.1370.872 治療后24.52±3.3323.85±3.3622.78±3.521.8430.163 凈增2.15±1.581.33±1.420.80±0.998.3500.000?? 凈增百分比 (%)9.90±7.386.15±6.923.96±5.286.5140.002??

3組間比較采用的是協(xié)方差分析；*P<0.05，**P<0.01

表4 2組治療前后糖脂水平和尿酸的協(xié)方差分析

觀察變量AA組(n=19)AC組(n=46)CC組(n=55)FP血糖/(mmol·L-1) 基線4.82±0.994.79±1.104.81±1.010.3100.963 治療后5.67±1.165.08±1.124.95±1.293.1790.045?糖化血紅蛋白(%) 基線5.37±0.565.28±0.605.33±0.690.1230.885 治療后5.97±0.705.73±0.625.51±0.633.8840.023?TC/(mmol·L-1) 基線4.54±1.134.37±0.984.49±0.880.2720.763 治療后4.98±1.084.81±1.054.62±1.031.0800.343TG/(mmol·L-1) 基線1.28±0.451.32±0.411.33±0.480.0680.934 治療后1.74±0.731.42±0.761.56±0.791.2880.280HDL/(mmol·L-1) 基線1.40±0.401.32±0.301.38±0.400.3970.673 治療后1.26±0.361.31±0.431.31±0.440.1180.890LDL/(mmol·L-1) 基線2.40±0.672.44±0.742.48±0.750.0700.932 治療后2.56±0.572.69±0.662.61±0.880.3970.673尿酸/(μmol·L-1) 基線263.74±95.30287.43±102.67266.76±84.440.8610.425 治療后268.31±121.28297.09±116.04285.23±103.310.3520.704

3組間比較采用的是協(xié)方差分析；*P<0.05，**P<0.01

2.5 藥物量及副反應(yīng)情況

本研究治療前后不良反應(yīng)主要有AA組血壓改變1例，失眠1例；AC組血壓改變1例，竇性心動過速2例，便秘1例；CC組出現(xiàn)2例血壓改變，2例肝功能輕度異常，1例竇性心動過速，均未出現(xiàn)明顯實驗室檢查異常，對癥治療后好轉(zhuǎn)。

3 討 論

MC4R首先由Huszar提出，他們發(fā)現(xiàn)MC4R突變基因的實驗鼠有攝食多，肥胖和高胰島素血癥的表現(xiàn)。動物實驗[14]表明，正常的MC4R功能在于抑制食欲和增加代謝率，減輕體質(zhì)量。此后的研究表明，定位于染色體18q22的人MC4R基因在維持能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，該基因上存在功能相關(guān)變異導(dǎo)致約6%的極度肥胖個體，是肥胖病的主效基因之一[15-16]。在MC4R基因的變異中，rs489693一直是肥胖遺傳機制研究的熱點，目前已有多個rs489693與抗精神病藥物所致肥胖相關(guān)性的研究認(rèn)為AA純合子比含C等位基因者增重明顯[17]。Czerwensky等[9]納入341例高加索人種的住院精神分裂癥患者，根據(jù)rs489693多態(tài)性分為AA、AC、CC 3組，經(jīng)SGA治療后發(fā)現(xiàn)rs489693的各個基因型在SGA治療后均表現(xiàn)出體質(zhì)量增加，而A等位基因體質(zhì)量增加尤為明顯，可能是發(fā)生肥胖的風(fēng)險因素。本研究經(jīng)12周奧氮平治療后，AA組在凈增體質(zhì)量、凈增BMI與其余2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，凈增BMI百分比與CC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示AA型基因比其他2種基因型更易導(dǎo)致體質(zhì)量增加。在糖脂代謝各項指標(biāo)中，AA組治療后血糖和糖化血紅蛋白均大于CC組，提示AA型等位基因比CC基因型更易導(dǎo)致血糖升高的風(fēng)險，研究結(jié)果與Czerwensky等[9]研究結(jié)果部分相同。不同的是，本研究的研究對象以病程較長的慢性精神分裂癥為主，使用的藥物均為奧氮平。本研究在進行比較后得出結(jié)論，AA型患者在奧氮平治療后體質(zhì)量增高和血糖升高的風(fēng)險明顯高于其他基因型患者，分析原因與MC4R基因變異導(dǎo)致功能缺陷有關(guān)。MC4R可通過作用于中樞黑素細胞皮質(zhì)素神經(jīng)元途徑(central melanocortin neuronal pathways)調(diào)控食物攝入和能量平衡，以及血糖水平[18]。MC4R rs489693的AA純合子是一種基因變異，或?qū)е翸C4R調(diào)控能量的功能缺陷，比含C等位基因有明顯的增重作用。此外，rs489693多態(tài)性影響MC4R的調(diào)控區(qū)域，通過MC4R表達的改變影響人體對血糖的利用和胰島素敏感性[19]，繼而導(dǎo)致血糖升高[20]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)奧氮平12周治療后，3組研究對象的精神癥狀均較基線明顯好轉(zhuǎn)，但3組間各項PANSS量表評分變化比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示AA、AC、CC及3種多態(tài)性對奧氮平的精神癥狀療效無明顯區(qū)別。有研究提出代謝不良反應(yīng)和抗精神病藥物的療效似乎存在某種關(guān)聯(lián)[20]。對易增加體質(zhì)量的藥物和療效較好的藥物分別排序，其等級排列極為相似(氯氮平>奧氮平>利培酮>喹硫平= 阿立哌唑=齊拉西酮)。甚至有學(xué)者提出代謝閾值(metabolic threshold)的概念，即抗精神病藥物能否起效取決于代謝不良反應(yīng)的情況[21]。以此推論，本課題組預(yù)期易導(dǎo)致代謝不良反應(yīng)(體質(zhì)量增加、血脂血糖升高)的AA基因型患者，其精神癥狀會改善更為明顯。但本研究卻并未發(fā)現(xiàn)此結(jié)果，原因可能與選擇人群和觀察時間較短有關(guān)，本研究的對象主要為慢性精神分裂癥患者，其精神病癥狀表現(xiàn)雖較基線好轉(zhuǎn)但改善幅度仍有限。此外，AA組的血脂增高與其余2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而血脂升高與精神癥狀的改善關(guān)系更為密切[21]。這提示有必要擴大觀察范圍，更多觀察時間，以驗證代謝反應(yīng)與精神癥狀間的關(guān)系。本研究中3組研究對象奧氮平使用量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，研究中未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，提示奧氮平總體安全有效。

本研究不足之處在于樣本量有限且僅來源上海地區(qū)的一家醫(yī)院，如果能擴大樣本量、采取多中心研究則或可減少因群體分層(population stratification)對結(jié)果導(dǎo)致的干擾。此外進一步研究可對代謝不良反應(yīng)與不同基因型患者精神癥狀緩解間的內(nèi)在聯(lián)系作測量，如睡眠情況的改善與否、食欲的好轉(zhuǎn)、胰島素水平等，以便更全面考察兩者間的關(guān)系，取得更明確的結(jié)論。

總之，本研究對慢性精神分裂癥患者的MC4R rs489693多態(tài)性進行分組對比研究，發(fā)現(xiàn)MC4R基因489693位點的AA基因型可能是慢性精神分裂癥患者發(fā)生體質(zhì)量增加和高血糖的風(fēng)險因素，該結(jié)果或許能為臨床上常見的慢性長期住院精神分裂癥患者發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量和糖脂代謝異常、及時調(diào)整用藥、改善代謝風(fēng)險綜合征提供借鑒意義。