●晁利芹 潘曉麗 王 付

赤丸是《傷寒雜病論》中辨治寒痰的重要用方之一，辨治“寒氣，厥逆”。導師王付教授根據(jù)張仲景用方要點并結合自身臨床經驗常用于辨治閉塞性脈管炎、深部靜脈炎以及慢性胃炎等。其方由烏頭、半夏、茯苓、細辛所組成，其中“烏頭與半夏”為用藥禁忌中“十八反”內容之一。為此筆者查閱了相關赤丸的實驗研究和臨床運用情況，發(fā)現(xiàn)其研究僅僅局限于相反藥對及單味藥[1]，故本課題重點開展赤丸方藥配伍的整體性及其相互關聯(lián)性的慢性毒性實驗研究，觀察其水煎液對大鼠心臟的毒理作用，以期為臨床安全用藥提供科學的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康清潔級Wistar大鼠，雌雄各半，共80只，體質量200±10g，購于河南省實驗動物中心，合格證號：SCXK（豫）2005-0001。動物房內的飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22℃±3℃，濕度60%±10%，聲響＜60分貝，無對流風，人工晝夜（12h／12h）。大鼠飼料由河南省實驗動物中心提供。本研究涉及所有實驗均通過河南中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會。

1.2 試劑與儀器75%乙醇：100mL，洛陽德之康生物工程有限公司，批號：090706；95%乙醇：2500mL，衛(wèi)輝市眾誠消毒制劑有限公司，批號：090206；烏拉坦：上海曹揚第二中學化工廠生產，批號：080517；肝素鈉注射液：2mL，12500U，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，產品批號：09 061012；甲醛溶液：天津市博迪化工有限公司，500mL/瓶，批號：20 080823；BL-420生物機能實驗系統(tǒng)檢測心電圖：成都泰盟公司；全自動生化分析儀：型號AT-738，上海安泰分析儀器有限公司；生物顯微鏡：型號OLYMPUS-CX40，日本奧林巴斯公司；輪轉式切片機：型號LEICA2025，德國徠卡儀器有限公司；電子天平：型號AE-240METTLER；賽多利斯精密天平：型號BS210S，北京賽多利斯天平有限公司；電熱恒溫干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；LEICARM2135型石蠟切片機：德國LEICA公司。

1.3 實驗藥物及制備實驗藥物：于鄭州市華龍中藥行購買茯苓、生川烏、遼細辛、法半夏四味中藥材，并由河南中醫(yī)藥大學藥學院鑒定合格。

藥物制備：依據(jù)全國高等中醫(yī)藥院?！督饏T要略》赤丸方的用量按重浸漬法[2]提取藥物成份，并濃縮為濃度200%（2g生藥/mL）的溶液。制備方法如下：取茯苓12g、生川烏6g、法半夏12g、遼細辛3g，依比例計算、稱量、粉碎所需受試藥物，將上藥混合用實驗所需的水溶液分三次提取有效成分，將三次浸提液混合過濾，調整至實驗所需容積，加熱沸騰后持續(xù)煎煮60min，濾其藥液；所得藥液的量即為當天各給藥組所需濃度為200%（2g生藥/mL）的溶液。

1.4 實驗方法（1）實驗動物分組：80只Wistar大鼠，雌雄各半分籠，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機每20只雌雄各半大鼠分為1組，共分4組，即赤丸水煎液高劑量組、中劑量組、低劑量組、正常對照組。

（2）實驗分期：實驗全程分為灌胃期和恢復期兩期。灌胃期是大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，持續(xù)灌胃90天的這個時期?；謴推谑枪辔附Y束后，每組隨機選10只大鼠處死檢測，剩余的40只大鼠停止灌胃，繼續(xù)一般飼養(yǎng)3周的這段時間。

（3）給藥方法：各給藥組根據(jù)人與大鼠的體表面積比，即大鼠用藥為人用藥量的7倍，依次按33g、16.5g、5.5g生藥/（kg·d）劑量灌胃，對照組用蒸餾水灌胃，灌胃體積為同等體重條件下高劑量組大鼠灌胃時所需藥液的劑量。每日定時（15：00）灌胃1次，6次/周灌胃，每周日檢測大鼠的體重，每周根據(jù)稱重情況調整給藥劑量，各組連續(xù)灌胃90天。

（4）實驗樣品收集：末次灌胃后，大鼠禁食不禁水2h，腹主動脈取血于普通的真空采血管中，4℃，3000r/min，離心15min，收集上清液，于-80℃保存?zhèn)溆?。采血完畢后，剖腹迅速取出完整心臟，除凈周圍的結締組織，切取大鼠同一部位的心臟組織，放入裝有4%甲醛溶液的標本瓶里，固定48h后，脫水，置于包埋盒中，做好標記，切片，HE染色，在光學顯微鏡下進行觀察心臟組織病理學變化。

（5）一般中醫(yī)癥候指標觀察：神志、皮毛、呼吸、行動、飲食、二便、分泌物等表現(xiàn)。

（6）心電圖檢測：灌胃前，每組隨機選10只大鼠在乙醚麻醉作用下采用BL-420生物機能實驗系統(tǒng)進行心電圖檢測，并于末次給藥后的次日的上午，進行相同的心電圖檢查。

（7）心功能指標測定：LDH、CK。在灌胃期結束末次大鼠心電圖檢測后，腹腔注射20%的烏拉坦（5mL/kg）進行麻醉，然后，從大鼠的腹主動脈取5mL血液，離心，存放，檢測。

（8）恢復期大鼠的檢測方法：進行與給藥期相同的檢測，借此觀察赤丸方的毒性反應是否具有可逆性，抑或是否出現(xiàn)遲緩性的毒性。

1.5 統(tǒng)計分析方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行整理和分析，計數(shù)資料用χ2檢驗，計量資料用t檢驗，各組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 赤丸水煎液對大鼠一般生長情況的影響在實驗過程中，除赤丸水煎液高劑量組大鼠外，其余各組大鼠在飼養(yǎng)期間，狀態(tài)良好，精神佳，活動靈活，皮毛光滑有色澤，食欲正常，未見異常分泌物。赤丸水煎液高劑量組大鼠飼養(yǎng)期間，精神不振，行動遲緩，皮毛不光滑，腹部微脹，食欲差并伴有不同程度的腹瀉。其中有2只大鼠在灌胃的第4、5周出現(xiàn)異常反應，體重增長較正常大鼠的速度慢，于第11、12周時，有5只大鼠出現(xiàn)了中毒反應，第67、83天，有2只大鼠死亡，隨即解剖2只大鼠制作心臟病理切片，觀察心臟組織形態(tài)。余實驗組沒有發(fā)現(xiàn)異常情況。

2.2 赤丸水煎液對大鼠體重的影響灌胃前：不同大鼠實驗組間體重無顯著差異（P＞0.05）；灌胃期：與正常對照組比較，赤丸水煎液低、中劑量組大鼠體重無顯著性差異（P＞0.05），赤丸水煎液高劑量組大鼠的體重明顯增長緩慢（P＜0.05），具有統(tǒng)計學意義。在動物試驗中，體重數(shù)值的高低可以作為整個機體變化的一個重要指標，在本課題的赤丸水煎液慢性毒理試驗過程中，每周稱量大鼠體重，既是調整給藥劑量的依據(jù)，又是觀察大鼠毒性反應的一個重要試驗指標。本課題結果證實，赤丸水煎液高劑量組大鼠的體重受到了很大的影響，余給藥組大鼠的體重未受到影響?；謴推冢翰煌o藥組大鼠的體重與正常對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。提示：長期大劑量口服赤丸水煎液對大鼠體重的增長具有影響作用，然而，一旦停止給藥一段時間后，就可恢復到正常體重。見表1。

2.3 赤丸水煎液對大鼠心電圖的影響灌胃前：與對照組比較，不同赤丸水煎液劑量組大鼠的心電圖包括心率，均無顯著性差異（P＞0.05）。灌胃期：與對照組比較，赤丸水煎液低、中、高劑量組大鼠的心電圖、心率均無顯著性差異（P＞0.05）?；謴推冢翰煌o藥組大鼠的心電圖、心率與正常對照組相比也無顯著性差異（P＞0.05）。本結果心率平均在335次/min。II、Ⅲ、avF導聯(lián)p波直立高尖，avR導聯(lián)倒置，時限、振幅正常，QRS波V1導聯(lián)主波向下，Ⅱ、Ⅲ、aVF向上，時限及振幅未見異常，J點抬高，T波前支陡后支緩。可以看出，長期灌服低、中、高劑量的赤丸水煎液對大鼠心臟無毒性反應。心電圖見圖1，心率結果見表2。

表1 各組大鼠體重比較（g，）

表1 各組大鼠體重比較（g，）

注：與對照組比較，★P＜0.05

圖1 赤丸方水煎液對大鼠心電圖的影響

2.4 赤丸水煎液對大鼠心肌酶的影響灌胃期：赤丸水煎液不同劑量組大鼠的LDH、CK與正常對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。本結果證實，赤丸水煎液低、中、高劑量組大鼠的心肌細胞均未受到損害?；謴推冢翰煌嗤杷逡簩嶒灲M大鼠的LDH、CK與正常對照組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。本課題結果說明，不論灌胃期，還是恢復期，赤丸水煎液低、中、高劑量組大鼠的心肌細胞均未受到損害。見表3。

表2 各組大鼠心率比較（次，）

表2 各組大鼠心率比較（次，）

2.5 赤丸水煎液對大鼠心臟的組織形態(tài)的影響整體情況：不同實驗組大鼠心臟的結構完整，表面光滑，形態(tài)體積、色澤均正常，未見水腫、充血、糜爛，組織無隆起、脫落，觸及質地也未發(fā)現(xiàn)異常。

形態(tài)組織學觀察：在灌胃期、恢復期，在光鏡下觀察實驗各組大鼠的心臟結構形態(tài)結果具有一致性，均可見到由心外膜、心肌膜、心內膜構成的心臟壁，心肌細胞排列整齊，核居中，無變性、壞死等損傷性改變，間質內未見炎性細胞浸潤、缺血、水腫等病理性改變。

表3 各組大鼠LDH、CK變化比較（U/L，）

表3 各組大鼠LDH、CK變化比較（U/L，）

本課題實驗結果表明，在灌胃期及恢復期，各組大鼠的心臟組織形態(tài)皆未出現(xiàn)異常。見圖2。

圖2 光鏡下赤丸水煎液對大鼠心臟形態(tài)學的影響

3 討論

王付教授在臨床中經常辨證使用赤丸方加味治療各種疑難雜癥[3]，療效卓著。由于赤丸組方之藥性的特殊性，所以進行該方的動物實驗研究是很有必要的。基于本實驗前期發(fā)現(xiàn)赤丸水煎方對機體肝、腎、內分泌系統(tǒng)均無毒性反應[4]，本研究則進一步探討赤丸水煎液有無心臟毒性的影響，借此觀察存否心臟的急毒與慢毒反應，是否具有可逆性。在給藥期，高劑量組大鼠體重增長顯著緩慢，但停藥21d后，大鼠體重恢復到正常水平。不論在給藥期還是恢復期，各組大鼠的心率、心電圖、心肌酶（LDH、CK）及心臟組織病理學均未現(xiàn)病理性改變。

赤丸方中雖然含有有毒中藥，且有十八反的配伍禁忌藥物，但是在研究中發(fā)現(xiàn)低、中、高濃度的赤丸水煎液對大鼠心臟均未產生不良的反應。赤丸方中，茯苓性味甘、淡、平，無毒副作用，且有免疫調節(jié)和保肝護肝的作用。細辛，辛、溫，有小毒。《中國藥典》將細辛的成人日用量定為不得超過3g[5]。在赤丸方中細辛用量為一兩（3g），屬安全范圍。烏頭辛、甘、大熱，有大毒，其毒性可隨煎煮時間延長而減弱或消失[6]。半夏辛、溫，有小毒。半夏與烏頭屬于十八反，屬配伍禁忌。但從藥理毒理相互作用上看，其毒性很可能被消除或減弱。烏頭的毒性主要為心臟的毒性及神經系統(tǒng)毒性。而現(xiàn)代藥理研究表明半夏具有鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)吐、抗心律失常的作用，能夠很好的拮抗烏頭引起的心臟毒性[7-9]。同時，細辛還具有強心、擴血管、降壓及保護心肌的作用。全方半夏燥濕化飲，茯苓利濕化飲，烏頭、細辛既能通陽散寒又能溫化寒飲，四藥相互為用，以建其功[10]。

綜上所述，赤丸方水煎液對心臟未見毒性反應，為臨床治療寒飲內阻之痼疾提供了動物實驗依據(jù)。