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南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院,1.呼吸內(nèi)科, 2.中醫(yī)科, 湖南 衡陽(yáng) 421000)

支氣管哮喘(Bronchial Asthma)是由多種原因共同作用引起的常見(jiàn)病，主要受到遺傳因素和環(huán)境因素的共同影響，一直是呼吸道疾病研究的熱點(diǎn)，但其發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制及調(diào)節(jié)機(jī)制仍未明確[1]。傳統(tǒng)中藥治療哮喘有多種方法，其作用溫和且副作用少，不僅可控制哮喘的急性發(fā)作，對(duì)于患者的遠(yuǎn)期愈后也具有十分重大的意義。柴樸湯作為治療哮喘的常用方劑，其療效已經(jīng)得到臨床驗(yàn)證，但其控制哮喘發(fā)作的機(jī)制尚不明確?；诖耍狙芯恳韵笫鬄閷?shí)驗(yàn)對(duì)象，采用基因芯片技術(shù)，在基因水平探究柴樸湯控制哮喘大鼠急性發(fā)作及后期修復(fù)的作用機(jī)制，為柴樸湯的臨床用藥，提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD大鼠18只，雄性，體重(200±20)g，南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供。

1.1.2 藥物和試劑 卵蛋白(OVA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(Ⅱ級(jí))；中藥配方顆粒購(gòu)自廣東一方制藥有限公司；Trizol、瓊脂糖、EB、TBE購(gòu)自Invitrogen公司；dNTP、RNase Inhibitor、M-MLV 購(gòu)自Takara公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自東盛生物技術(shù)股份有限公司;PCR引物購(gòu)自江蘇聯(lián)川生物技術(shù)有限公司；Phalanx Rat OneArray基因芯片購(gòu)自臺(tái)灣華聯(lián)生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及造模 18只健康SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分3組，即正常組、哮喘組及柴樸湯干預(yù)哮喘組，每組6只。哮喘造模于第1天與第8天，腹腔注射1 mg卵蛋白加100 mg氫氧化鋁配成1 mL生理鹽水混懸液，第15天開(kāi)始，以1%卵蛋白霧化吸入，隔天1次，連續(xù)7次，每次持續(xù)30分鐘。柴樸湯干預(yù)哮喘組每次霧化前半小時(shí)予以柴樸湯2 mL灌胃；哮喘組予以生理鹽水2 mL灌胃；正常組給予生理鹽水1 mL致敏、霧化，2 mL生理鹽水灌胃作為對(duì)照。

1.2.2 肺泡灌洗液炎癥相關(guān)細(xì)胞計(jì)數(shù) 取左側(cè)肺組織行嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophils，EOS)和白細(xì)胞(White blood cell, WBC)計(jì)數(shù)，以生理鹽水行肺泡灌洗，收集灌洗液離心(2000 r/min離心20min)，回收細(xì)胞，油鏡下計(jì)數(shù)瑞士染色后細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.3 HE染色 造模成功后，采用腹主動(dòng)脈放血法處死大鼠，取大鼠肺組織，以10%的甲醛溶液固定，行HE染色，光鏡下分析肺組織的病理變化。

1.2.4 基因芯片試驗(yàn)及分析 肺組織RNA提取后，基因表達(dá)分析使用 Phalanx Rat One Array 基因芯片，用激光共聚焦掃描儀對(duì)雜交后的芯片進(jìn)行掃描，同時(shí)扣除背景雜交信號(hào)值，每組樣品均需行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè) 使用Real-Time PCR檢測(cè)肺組織MAL及TPD52的表達(dá)，待反應(yīng)結(jié)束后收集所有反應(yīng)體系中目的基因的初始表達(dá)量。將每組目的基因的CT值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)應(yīng)的CT值對(duì)照，得到MAI基因及TPD52L基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 柴樸湯對(duì)肺泡灌洗液中EOS及WBC數(shù)量的影響

與正常組對(duì)照，哮喘組中EOS及WBC的數(shù)目增多; 與哮喘組對(duì)比，柴樸湯干預(yù)組中上述炎性細(xì)胞數(shù)目均顯著降低(見(jiàn)表1)。

表1 各組BALF中嗜酸性粒細(xì)胞及白細(xì)胞數(shù)量

2.2 柴樸湯對(duì)哮喘大鼠肺組織病理改變的影響

肺組織HE染色后可見(jiàn)：正常組肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，管壁無(wú)增厚，管腔未見(jiàn)狹窄，周?chē)鷥H少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；哮喘組可見(jiàn)管壁增厚明顯，管腔狹窄，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；柴樸湯干預(yù)后，管壁增厚不如哮喘組明顯，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)也明顯下降(見(jiàn)圖1)。

2.3 基因芯片雜交結(jié)果

芯片掃描后顯示顯示信號(hào)強(qiáng)度均勻，基因點(diǎn)清晰。一個(gè)基因的表達(dá)由一個(gè)熒光亮點(diǎn)表示，亮度越高、數(shù)量越多，代表表達(dá)量越高(見(jiàn)圖2)。

圖1 柴樸湯對(duì)哮喘大鼠肺組織的影響

圖2 基因芯片掃描圖

2.4 熒光定量PCR分析結(jié)果

哮喘組MAL基因的表達(dá)顯著低于正常組，在柴樸湯干預(yù)后，可見(jiàn)其出現(xiàn)上調(diào)；在哮喘組中TPD52L基因表達(dá)較正常組顯著升高，柴樸湯干預(yù)后，其表達(dá)發(fā)生下調(diào)(見(jiàn)表2)。

表2 各組差異表達(dá)基因的熒光定量PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果對(duì)比

3 討 論

本課題組前期通過(guò)基因芯片技術(shù)，篩選出與哮喘致病密切相關(guān)的MAL及TDP52L1基因，從整體分子學(xué)水平研究哮喘發(fā)病的病因及可能的病理生理機(jī)制[2]。

MAL為T(mén)-淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白，是一種主要表達(dá)于細(xì)胞表面的頂端膜蛋白，可參與上皮細(xì)胞的分泌與吸收[3]。同時(shí)，也有研究發(fā)現(xiàn)Mal可作為囊泡形成與運(yùn)輸相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)頂端膜物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌，通過(guò)維持上皮細(xì)胞極性，調(diào)節(jié)多種疾病的發(fā)病過(guò)程，其分布狀態(tài)的改變及表達(dá)量的下調(diào)，可影響正常細(xì)胞極性，介導(dǎo)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[4-5]。本課題組在在前期哮喘大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，隨著哮喘炎癥反應(yīng)的進(jìn)展，MAL基因呈明顯的下調(diào)趨勢(shì)。TPD52L1是癌蛋白52(D52)家族成員之一。TPD52L1的基因擴(kuò)增與病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖及腫瘤細(xì)胞的增生都密切相關(guān)[6]。Proux V證實(shí)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的TPD52L1能夠促使雞的神經(jīng)膠質(zhì)上皮細(xì)胞增生, 又證實(shí)了D52家族基因表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞的增生[7-8]，結(jié)合前期基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)TPD52L1在肺組織中的表達(dá)隨著哮喘病程的進(jìn)展逐漸上調(diào)，據(jù)此推測(cè)TPD52L1通過(guò)參與上皮細(xì)胞的增生，影響哮喘疾病的進(jìn)展。

氣道炎癥及氣道重塑是組成哮喘病理變化的兩大基石，但目前其治療仍是以抑制炎癥的糖皮質(zhì)激素為主，這對(duì)改善患者的氣道重塑效果差且副作用多，所以急需尋找一種既無(wú)明顯副作用又可以長(zhǎng)期應(yīng)用，同時(shí)擁有良好平喘作用的藥物。柴樸湯是針對(duì)哮喘病理機(jī)制而設(shè)的方劑，該方可顯著的抑制疾病變態(tài)反應(yīng)并有鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)靜、解痙、抗炎、祛痰、和增強(qiáng)非特異性抗感染免疫功能的作用[9-10]。作為治療哮喘的常用方劑，柴樸湯治療哮喘的臨床療效已經(jīng)得到充分證實(shí)[11]。本研究通過(guò)基因芯片及實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)柴樸湯可上調(diào)MAL基因及抑制TPD52L1基因在肺組織中的表達(dá)，減輕哮喘氣道炎癥及重塑的程度，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)，筆者推測(cè)柴樸湯可能通過(guò)影響MAL及TPD52L1在肺組織氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)，維持氣道上皮組織功能，阻斷上皮組織細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制哮喘氣道炎癥及重塑的進(jìn)程。