慈紅非，武世伍，柴大敏，馬 莉，秦燕子，陶儀聲

直腸癌是我國消化道常見的癌癥之一，30年來，直腸癌發(fā)病率年均上升3%～4%[1-2]。因為其解剖位置深入盆腔，與周圍組織關(guān)系復(fù)雜，所以手術(shù)難度高，腫瘤切除不易徹底，導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率都高。直腸癌的發(fā)生及發(fā)展是多因素相互協(xié)同作用的結(jié)果，過程中受到多種相關(guān)基因的調(diào)控[3-4]。而血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)是各種腫瘤細(xì)胞依賴自身可塑性而形成的獨立于內(nèi)皮血管的供血系統(tǒng)。目前已有大量應(yīng)用免疫組織化學(xué)(免疫組化)方法研究血管生成擬態(tài)在相關(guān)腫瘤中作用的文獻(xiàn)，研究技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟。本研究通過相關(guān)免疫組化技術(shù)研究VM的存在與直腸腺癌病人相關(guān)臨床病理指標(biāo)之間的聯(lián)系。現(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究通過篩選后收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2012-2014年送檢的直腸腺癌組織標(biāo)本176例以及對應(yīng)的癌旁正常組織，臨床病理資料及隨訪資料皆完整，入選病人隨訪至其死亡或截至2017年1月，隨訪時間為3～68個月。其中男123例，女53例；年齡36～85歲。

1.2 主要試劑 鼠抗人單克隆抗體CD34、EliVisionTMplus試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自中國福州邁新生物技術(shù)有限公司；高碘酸-希夫染液(PAS)購自中國上海匯長生物科技有限公司。

1.3 試驗方法 免疫組化CD34和PAS雙重染色：石蠟切片經(jīng)過常規(guī)處理后按照試劑盒說明書的染色步驟進行CD34抗體染色，DAB顯色后置于鏡下觀察，至血管內(nèi)皮細(xì)胞著色后，可停止顯色反應(yīng)；然后避光環(huán)境下置于0.5%的PAS溶液中反應(yīng)半小時左右再次觀察即可。

1.4 結(jié)果判定 VM的結(jié)構(gòu)特征：VM結(jié)構(gòu)管壁CD34為陰性，而正常血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34則為陽性，表明VM中無正常血管內(nèi)皮細(xì)胞參與其形成；VM結(jié)構(gòu)管腔中亦可見紅細(xì)胞存在，紅細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞可見PAS陽性的基底膜樣結(jié)構(gòu)，上述特征性結(jié)構(gòu)可判定為VM。免疫組化結(jié)果的判定是由病理科兩位高年資醫(yī)生通過獨立雙盲法得出。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t′檢驗和χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 直腸腺癌VM的存在情況 176例直腸腺癌中有35例VM表達(dá)為陽性，陽性率19.89%，典型結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2 VM與各相關(guān)參數(shù)之間的關(guān)系 不同性別、年齡組及腫瘤的長徑間VM的形成差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) ；而在低分化組、伴有血管、神經(jīng)侵犯組、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的VM陽性率顯著較高(P<0.01) (見表1)。

2.3 總體生存時間的多因素分析結(jié)果 以總生存率為因變量(死亡=0，生存=1)，以VM、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管、神經(jīng)侵犯為自變量進行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果顯示，VM的陽性率越高，病人的生存時間越短(P<0.01)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人生存時間短(P<0.01)；有血管、神經(jīng)侵犯的病人比無血管、神經(jīng)侵犯的病人生存時間短(P<0.05)(見表2)。

2.4 總體生存時間的單因素分析結(jié)果 本組病例總的5年生存率為27.84%(49/176)。Log-rank分析結(jié)果顯示VM陽性表達(dá)組與陰性表達(dá)組的平均生存時間分別為(11.3±7.7)月和(41.9±14.6)月，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t′=17.09，P<0.01)。

3 討論

1999年，美國MANIOTIS等[5]首次提出了一種獨立于內(nèi)皮血管的腫瘤血液供應(yīng)模式，即VM。其概念為：腫瘤細(xì)胞通過脈管系統(tǒng)表現(xiàn)一定的可塑性,從而形成似血管樣的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并與宿主自身的血管相連[6],為腫瘤細(xì)胞提供血供。VM的提出對傳統(tǒng)思維中腫瘤血供的方式提出了挑戰(zhàn)，同時也是對腫瘤血管生成理論[7-8]重要的補充。在隨后的研究中表明VM不僅在人眼葡萄膜黑素瘤中存在，在肝癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中同樣存在[9-12]，而且VM的存在與腫瘤的分化程度、病人的生存時間、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等因素[13]密切相關(guān)。

雖然在越來越多的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了VM現(xiàn)象，但是生成VM的分子機制仍不清楚，獲取VM功能最顯著的分子決定因素之一是內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VE-鈣黏蛋白的表達(dá)，VE-鈣黏蛋白是一種常在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的跨膜蛋白，主要功能是促進細(xì)胞黏附[14]，研究發(fā)現(xiàn)VE-鈣黏蛋白通?？梢栽趷盒猿潭燃扒忠u性高的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，但不能在侵襲性差的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[15]。研究[16]表明VE-cadherin/EphA2/PI3K/MMP是VM形成的關(guān)鍵通路，同時缺氧微環(huán)境、環(huán)氧化醇-2等因素對VM結(jié)構(gòu)的形成也起一定的促進作用。除上述機制外，仍有很多VM相關(guān)的機制有待深入研究和進一步探索，例如體外培養(yǎng)的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤干細(xì)胞，部分能夠分化成平滑肌樣細(xì)胞，可以表達(dá)內(nèi)皮相關(guān)基因，進而形成血管樣的結(jié)構(gòu)。不同的腫瘤細(xì)胞可以在三維培養(yǎng)條件下形成不同結(jié)構(gòu)的VM，相關(guān)結(jié)果表明可塑性越強、侵襲性越高的腫瘤細(xì)胞更易形成VM[5]，但是仍有部分現(xiàn)象有待進一步研究闡釋。

表1 直腸腺癌臨床病理參數(shù)與VM的關(guān)系

表2 176例直腸腺癌病人的多因素分析

目前臨床上抗腫瘤血管生成的相關(guān)治療多以促血管生成因子或相關(guān)受體為靶點，其特異性較易受到多種因素干擾，對VM結(jié)構(gòu)的敏感性差，治療效果也達(dá)不到預(yù)期的目標(biāo)。VM的發(fā)現(xiàn)是對腫瘤血管生成理論的重要補充，為臨床進行抗腫瘤血管生成相關(guān)治療提供了新的研究思路。相關(guān)研究[17]顯示，存在VM的黑素瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤的病人預(yù)后較差，存在VM的直腸癌總體中位生存時間更短。研究直腸腺癌的血液供應(yīng)模式，找到有效的抗血管措施，對今后的臨床抗腫瘤血管藥物的研制以及抗腫瘤治療提供新的理論顯得尤為重要。