陳 麗，周 浩，何宏天，管 政

輸血相關(guān)急性肺損傷(transfusion-related acute lung injury，TRALI)是臨床輸血并發(fā)的急性呼吸窘迫綜合征，一般在輸入血液、血漿及相關(guān)血制品6 h內(nèi)發(fā)生，是輸血相關(guān)死亡的首要原因[1-2];目前尚未引起我國廣大臨床醫(yī)生和輸血醫(yī)學(xué)工作者的重視，臨床上無法獲得準(zhǔn)確的診斷和及時(shí)有效的治療。TRALI的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，普遍接受的抗原抗體反應(yīng)學(xué)說認(rèn)為，人類中性粒細(xì)胞抗原(HNA)抗體是導(dǎo)致TRALI的最重要的抗體，其中針對HNA-3a抗原的同種抗體?？梢鹬旅腡RALI[3]。HNA-3a抗原存在于粒細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腎臟、脾臟、胰腺等細(xì)胞上。1964年VAN LEEUWAN等[4]在血清學(xué)水平鑒定到HNA-3a抗原，2010年HNA-3a抗原的分子基礎(chǔ)被闡明，HNA-3a抗原位于膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)樣蛋白-2(CTL-2)上。CTL-2蛋白是一種跨膜蛋白，由19號(hào)染色體19p13.1區(qū)域中的SLC44A2基因編碼，其外顯子7中的單個(gè)核苷酸替換(461G>A；Arg154Gln)導(dǎo)致基因多態(tài)性引起HNA-3系統(tǒng)的多樣性[5]。因?yàn)镠NA-3a的免疫原性較強(qiáng)，有妊娠史或輸血史的HNA-3b/3b的純合子個(gè)體被免疫產(chǎn)生HNA-3a抗體的可能性較大。目前沒有方便快捷檢測人群中HNA-3a抗體發(fā)生頻率的實(shí)驗(yàn)方法，本課題克隆了人HNA-3a基因，并構(gòu)建pEGFPN3-HNA-3a真核表達(dá)載體，在HEK-293細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)和鑒定，為今后運(yùn)用HNA-3a抗原檢測HNA-3a抗體打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HEK-293細(xì)胞和 DH5α菌為蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理實(shí)驗(yàn)室保存。高糖DMEM(美國Gibico公司)；胎牛血清(杭州四季青)；Trizol試劑(美國Gibico公司)；PBS緩沖液(美國Solarbio公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；真核表達(dá)載體 pEGFP-N3、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和Kpn均購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。T4連接酶、PfuDNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自 Promega公司。質(zhì)粒純化試劑盒及膠回收試劑盒為上海華舜生物公司產(chǎn)品。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒為美國 Invitrogen 公司產(chǎn)品。鼠單克隆抗體Flag(M2-3165)購自Sigma-Aldrich公司。抗GADPH抗體購自天津三箭公司。HRP二抗購自Santa Cruz。

1.2 方法

1.2.1 人HNA-3a cDNA合成和RT-PCR GeneBank調(diào)取表達(dá)HNA-3a抗原的純合子的CDS基因序列(SLC44A2)，利用Vector NTI設(shè)計(jì)引物。用Trizol試劑抽提HNA-3a純合子個(gè)體RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以該cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物：5′-TTT GTT AGA CGA AGC TTG GGC TGC AGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC GCC ACC-3′，在5′端引入XhoⅠ的酶切位點(diǎn)；下游引物：5′-CCG GTC GCC ACC ATG GTG AGC AAG GG-3′，在5′端引入KpnⅠ的酶切位點(diǎn)；反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)，最后于72 ℃延伸8 min。將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.2 人HNA-3a基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與pEGFP-N3載體分別以XhoⅠ、KpnⅠ進(jìn)行雙酶切。將酶切后的目的基因與載體經(jīng)T4 DNA連接酶于4 ℃連接過夜，并轉(zhuǎn)化DH5a菌。挑取陽性克隆經(jīng)振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，以XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定符合的克隆送上海吉?jiǎng)P公司進(jìn)一步測序鑒定。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選 HEK-293細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)。融合取對數(shù)生長期細(xì)胞按5×105/孔接種至6孔板，每孔加入2 mL DMEM，待細(xì)胞增殖融合達(dá)80%面積時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前更換Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染的步驟及方法參照LipofectamineTM2000試劑說明書，同時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-N3空載體作為陰性對照，轉(zhuǎn)染48 h后觀察轉(zhuǎn)染效率。按文獻(xiàn)[6]報(bào)道方法，用0.6 μm/mL G418培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞。篩選2.5周后接種24孔板，連續(xù)稀釋、挑選單克隆細(xì)胞擴(kuò)增。篩選出的目的基因穩(wěn)轉(zhuǎn)株置于顯微鏡下，藍(lán)光激發(fā)，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中HNA-3a蛋白的表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后第3天收集培養(yǎng)板中的細(xì)胞，用1% NP-40裂解緩沖液裂解并提取蛋白。利用BSA標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后算得待測品蛋白濃度。配制濃度為10%的分離膠，將細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉并室溫孵育1 h，減少非特異性結(jié)合后，按1∶1 000的比例稀釋的鼠單克隆抗體Flag (C端融合Flag標(biāo)簽)4 ℃孵育過夜。次日，用0.1%的PBST洗膜3次后，加入1∶5 000倍稀釋的二抗，室溫孵育1 h。洗膜3次后加顯影液，觀測蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 人HNA-3a cDNA的RT-PCR擴(kuò)增 人HNA-3a基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果見圖1，在2 167 bp處出現(xiàn)一條明亮的條帶，與預(yù)期的目的基因大小相符。

2.2 pEGFP-N3-HNA-3a表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 PCR擴(kuò)增后的片段經(jīng)XhoⅠ、KpnⅠ雙酶切后，克隆到同樣經(jīng)XhoⅠ、KpnⅠ雙酶切的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3中。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后篩選出對相應(yīng)抗生素具有抗性的陽性克隆，制備少量的質(zhì)粒，用XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，可切出約986 bp大小的片段，同預(yù)期的結(jié)果一致(見圖2)。陽性克隆測序結(jié)果經(jīng)比對，序列完全正確，說明HNA-3a基因已成功克隆至pEGFP-N3載體中。

2.3 pEGFP-N3-HNA-3質(zhì)粒在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定 將pEGFP-N3-HNA-3a重組質(zhì)粒和pEGFP-N3空載體分別轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后24 h即可在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染細(xì)胞中GFP熒光的表達(dá)，但表達(dá)量較少，GFP的表達(dá)量隨著時(shí)間的延長逐漸增加，至72 h最強(qiáng)(見圖3)。Western blotting檢測表明，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株HNA-3a蛋白水平有表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞上HNA-3a不表達(dá)(見圖4)。

3 討論

目前，TRALI仍然是輸血相關(guān)死亡的首要原因[1-2]。據(jù)美國FDA統(tǒng)計(jì)顯示，在2011-2015年，每年TRALI死亡病例數(shù)占輸血相關(guān)死亡人數(shù)的38%[7]。在已知的TRALI的發(fā)病案例中，HNA-3a抗體是導(dǎo)致致死性TRALI的主要原因。HNA-3a抗原的免疫原性較強(qiáng)，一般由輸血或妊娠產(chǎn)生。因此，采供血機(jī)構(gòu)應(yīng)對有妊娠史或輸血史的供者血漿進(jìn)行HNA-3a抗體的篩查，以減少或避免TRALI的發(fā)生?？墒怯捎谖覈鴩榈南拗?，并未像歐美等一些發(fā)達(dá)國家一樣禁止使用有妊娠史或輸血史的供血者血漿，同時(shí)由于種種原因我們目前不僅不了解HNA-3a抗體在特定人群中的發(fā)生頻率，更沒有開展HNA-3a的篩查工作，這就可能大大增加了TRALI發(fā)生的概率。

迄今HNA-3a抗體的檢測沒有商業(yè)化的抗原可供使用，用細(xì)菌表達(dá)出的可溶性肽類運(yùn)在ELISA方法中并不能檢測出目標(biāo)抗體，這可能與抗原表達(dá)中的轉(zhuǎn)錄后糖基化修飾有關(guān)[8-9]。目前，國際上通用的檢測HNA抗體的方法是ISBT工作組推薦的兩種經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，分別是中性粒細(xì)胞聚集實(shí)驗(yàn)(GAT)和中性粒細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)(GIFT)。不過這兩種實(shí)驗(yàn)在檢測過程中需要從確定HNA基因型的志愿者中分離出新鮮的粒細(xì)胞，既艱苦又耗時(shí)，不適用于常規(guī)的篩選工作[10]。因此，研究出一種更加簡便、快速的HNA-3a抗體檢測方法對預(yù)防TRALI具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

BAYAT等[11]在研究中分別構(gòu)建了含不同長度HNA-3基因外顯子的表達(dá)載體，結(jié)果顯示縮短的外顯子構(gòu)建的載體表達(dá)的蛋白不識(shí)別HNA-3a的特異性，只有全長外顯子序列表達(dá)的抗原的免疫原性才能識(shí)別所有抗體。另WOZNIAK等[6]也證實(shí)了這一研究，并且在SLC44A2全長序列的153、154、301位置必須為精氨酸、亮氨酸、蘇氨酸，這樣表達(dá)的蛋白才具有HNA-3a的抗原性。因此，本研究將153、154、301位置分別突變?yōu)榫彼?、亮氨酸、蘇氨酸的SLC44A2基因全長編碼序列克隆到了pEGFP-N3真核表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中。G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的HNA-3a免疫印跡結(jié)果和綠色熒光均證實(shí)了HNA-3a在HEK293細(xì)胞中得到了穩(wěn)定有效的表達(dá)，表明了我們成功地構(gòu)建了能夠穩(wěn)定高效表達(dá)HNA-3a的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,這為我們下一步研究檢測血漿中的HNA-3a抗體的方法打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，從而為開展人群中HNA-3a抗體篩檢工作提供技術(shù)上支持。