車妤杰,彭佳昊,王浩嘉,劉詩雨,杜昊男,舒 剛,呂 程

（四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都610000）

《傷寒論·厥陰篇》記載的當歸四逆湯[1]有活血化瘀之效[2]，花椒有抗炎鎮(zhèn)痛[3]、抗氧化和改善缺血等作用[4]。有研究表明[5]，加味花椒兩者同用可增強溫經通脈的療效。

根據齊笑等人的研究[6]可知噴膜劑一般選擇聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羥丙甲基纖維素（HPMC）、殼聚糖等中的一種或幾種作為主要成膜材料。其中PVP系列的成膜效果最好，可單獨成膜，且種類多樣，其中成膜效果與其分子量呈正比關系，當K＜30時耗材大效果不佳，而K90分子量過大，形成的溶液粘稠難以呈噴射狀，而PVPK－30各方面效果良好，是目前噴膜劑最主要的成膜材料。殼聚糖鹽酸鹽是一種水溶性好且具備殼聚糖[7]所有優(yōu)點的生物成膜材料[8]，可搭配其余材料制成良好的噴膜劑。中藥配方中5種藥材當歸、赤芍、甘草、花椒和大棗均含有黃酮類成分[9－13]，則可確定黃酮為試驗復方主要活性成分。

試驗旨在研制出一種使用方便，能加強藥物吸收性的噴膜劑，通過薄層色譜對樣品進行定性鑒別，并根據2015版《中國藥典》[14]測定總黃酮含量，為研究中藥復方當歸四逆湯的新型外用劑型提供基礎數據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 低速離心機SC－3614（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；U－2800A紫外分光光度儀（上海尤尼柯儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（海門市艾斯特試驗器材廠）；旋轉蒸發(fā)儀；1XC－110A型超聲波清洗器（濟寧鑫欣超聲電子設備有 限公司）；真空泵；RHYB－4磁力攪拌器（常州市人和儀器廠）；電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）；ZF－1三用紫外分析儀紫外光燈（上海馳唐實業(yè)有限公司）；細菌培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；硅膠GF254薄層板；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）。

1.2 材料 當歸、桂枝、赤芍、細辛、炙甘草、通草、大棗（七種藥材均來自溫江福壽堂大藥房）；花椒（購買自溫江宜家樂購物中心）；殼聚糖鹽酸鹽（山東優(yōu)索化工科技有限公司，脫乙酰度90%）；薄荷腦（安國藥源商貿有限公司）；乙醇；PVPK－30；丙三醇；碳酸氫鈉；二甲苯；三氯甲烷；乙酸乙酯；冰醋酸；乙醚；甲醇；正丁醇；亞硝酸鈉；硝酸鋁；NaOH；阿魏酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:110773－201614）；芍藥苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:110736－201842）；蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:100080－201610）；5%香草醛硫酸溶液（由乙醇和98%濃硫酸配制）。

2 方法與結果

2.1 藥材提取 稱取當歸54 g，桂枝27 g，赤芍54 g，細辛3 g，炙甘草18 g，通草18 g，大棗27 g，花椒 18 g，將全部藥材先以適量水浸潤30 min，再加水煎煮2次，依次為處方的8倍量和6倍量水，煎煮時間依次為1.5 h和1 h，合并上面兩次的水煎液，并在60℃減壓濃縮，冷卻至室溫，用1 moL·L－1的NaHCO3調pH值使藥液pH值在5～7之間，攪拌均勻，4℃冷藏備用。

2.2 正交試驗 通過正交試驗確定試驗成膜材料殼聚糖鹽酸鹽（A）、PVPK －30（B）、乙醇（C）的水平用量，進行三因素三水平L9（34）正交試驗[8]，安排如表1。通過對樣品成膜性、成膜時間以及溶液澄清度及噴射效果進行打分，最好者為100分，依次降低10分，計算綜合得分以此作為評價指標。

表1 設計三因素三水平表Tab 1 Designs a three-factor three-level table

表2 正交試驗結果Tab 2 Orthogonal test results

表3 正交試驗評價指標Tab 3 Evaluation index of orthogonal test

表4 各水平均值Tab 4 Means of each level

表5 方差及顯著性分析Tab 5 Variance and significance analysis

在第3項溶液澄清度及噴射效果的評價時，因每組樣品均為紅棕色澄清透明液體，無法比較，則不并入綜合得分中。用SPSS18.0中處理數據的結果表明，因素A、B、C的P值均大于0.05，無顯著影響，不必再進行各因素水平間多重比較。此時，可從表4中選擇平均值最大的水平成最優(yōu)水平組合，即1%殼聚糖鹽酸鹽、3%PVPK－30和40%無水乙醇為最佳成膜配比。

2.3 樣品制備及性狀 依次稱取處方量的殼聚糖鹽酸鹽和薄荷腦粉末加入適量蒸餾水中，磁力攪拌至溶解，再加入3%量的甘油繼續(xù)充分攪勻，另稱取PVPK－30加入到400 mL乙醇中溶解。將上述溶液混勻之后加入藥液，再混合均勻，最后加蒸餾水定容至1 L，即得樣品溶液（生藥濃度為219 mg/mL），分裝，且樣品為澄清的清涼氣味的紅棕色溶液。

2.4 薄層色譜鑒定 當歸中阿魏酸的鑒定:取本品10 mL，置分液漏斗中，加水10 mL，加乙醚30 mL振搖提取，分取乙醚液，水浴蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取阿魏酸對照品，加甲醇制成1 mg·mL－1的溶液，作為對照品溶液。按制備工藝制成缺當歸的陰性制劑樣品，并按供試品溶液制備方法制備，作為缺當歸的陰性對照溶液。吸取供試液10μL，對照品溶液和陰性對照品溶液各2μL分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯（4∶1）為展開劑[14]，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視，結果表明，樣品與阿魏酸對照品在同一位置顯示紫色斑點，而陰性對照無此斑點，結果說明樣品當歸中含有阿魏酸成分且無陰性干擾。

圖1 阿魏酸薄層色譜圖Fig 1 TLC of ferulic acid

赤芍中芍藥苷的鑒定:取本品20 mL，加水20 mL，搖勻，加正丁醇40 mL振搖提取，分取正丁醇液，水浴蒸干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。按制備工藝制成缺赤芍的陰性制劑樣品，并按供試品溶液制備方法制備，作為缺赤芍的陰性對照溶液。吸取上述三種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 －乙酸乙酯 －甲醇 －甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑[14]，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰，在日光下檢視，結果表明，樣品與芍藥苷對照品在同一位置顯示藍紫色斑點，而陰性對照無此斑點，結果說明樣品赤芍中含有芍藥苷成分，且無陰性干擾。

圖2 芍藥苷薄層色譜圖Fig 2 TLC of paeoniflorin

2.5 總黃酮的含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備 精確稱取蘆丁對照品0.0118 g，在50 mL容量瓶中加入40 mL 30%乙醇溶液，置超聲清潔儀中以20℃超聲30 min使溶解，放冷，加30%乙醇定容至刻度，搖勻，得0.2360 mg/mL蘆丁對照品溶液。

2.5.2 最大吸收波長的確立 在200～600 nm范圍之間內進行紫外掃描確定最大吸收波長為356 nm。

2.5.3 標準曲線的制備 精密量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL上述對照品溶液，分別放于6只干燥潔凈的25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6.0 mL。精密移取1.0 mL的5%NaNO2溶液于容量瓶中，振搖后靜置6 min，再精密量取1.0 mL 的10%Al（NO3）3溶液加入容量瓶中，震蕩搖勻后靜置6 min，然后精密移取10 mL 4%氫氧化鈉溶液于容量瓶中，最后使用30%乙醇溶液定容，震蕩搖晃均勻后靜置15 min，待測。使用不添加對照品的空白試劑作為參比，在356 nm處測定吸光度值A。結果表明，蘆丁對照品的線性回歸方程為Y＝0.0232X－0.211，相關系數r2＝0.9941，在線性范圍0～47.20μg/mL內呈良好的線性關系。

2.5.4 總黃酮的含量測定 用移液管精確量取樣品5 mL加入50 mL容量瓶中，再加入30%的乙醇溶液40 mL，置超聲清潔儀中以20℃超聲30 min使溶解，放冷，加30%乙醇定容至刻度，搖勻，之后用布氏漏斗真空減壓抽濾。準確量取25 mL續(xù)濾液轉移于50 mL容量瓶中，用30%乙醇溶液稀釋至刻度定容，搖勻，即得供試品溶液。然后精密量取供試品溶液5 ml于25 mL容量瓶中，按2.5.3項下方法，從“加30%乙醇至6.0 mL”開始進行操作，測定吸光度，依法測定吸光度。同時不加供試品溶液同上操作，作為空白，帶入線性回歸方程中，計算求得10組樣品總黃酮含量。

表6 樣品含量測定Tab 6 Sample content determination

結果表明，每瓶總黃酮含量在吸收值（A）在0.452～0.483范圍內，且1～10組樣品中每瓶總黃酮量分別為:1.89、1.83、1.93、1.97、1.93、1.88、1.92、1.93、1.99 及 1.86 mg/mL，則確定質量標準為每瓶含總黃酮1.83 mg/mL。

3 討論與結論

3.1 成膜材料的選擇 通過Yuan等[15]的研究可知其中聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的成膜效果最好，樊榮丹[8]研究表明其衍生物殼聚糖鹽酸鹽是水溶性很好的材料擁有殼聚糖全部優(yōu)點。試驗發(fā)現殼聚糖鹽酸鹽和PVPK－30以及無水乙醇以不同比例所做出的樣品的噴膜性相差很大，并且當加入1%的殼聚糖鹽酸鹽和3%的PVP－K30以及40%的無水乙醇時噴膜效果最好。

3.2 樣品中阿魏酸、芍藥苷的薄層鑒定 阿魏酸是當歸的重要成分，具有抗氧化和抗菌消炎的功能[16]，也用于抑制血小板聚集和血栓預防[17]等方面。赤芍中的芍藥苷可抗血小板聚集和抗血栓形成[18]，也具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、解熱解痙抗炎等功能。參考羅音久等[19]和林翠華等[20]對阿魏酸及芍藥苷的薄層色譜鑒定方法，得出了試驗樣品含有阿魏酸和芍藥苷且無陰性干擾。

3.3 總黃酮含量的測定 黃酮類化合物具有作為外用制劑的多方面的優(yōu)點，包括抗菌消炎止痛、促愈合、清熱解毒、改善血液循環(huán)等作用。黃酮為本試驗復方的主要活性成分并將其作為主藥含量測定的對象。本試驗通過實驗室的紫外分光光度計進行最大吸收波長的掃描確定，發(fā)現本機器上蘆丁對照品的最大吸收波長為356 nm。并且檢測了試驗的精密度、穩(wěn)定性和重復性以及加樣回收率[21]均良好，且得出標準為每瓶含總黃酮的含量為1.83 mg/mL。

3.4 結論 當歸四逆湯可活血化瘀，花椒可抗炎鎮(zhèn)痛及改善組織缺血，二者同用可增強溫經通脈的療效，還能扶正祛邪及標本兼顧。而現今當歸四逆湯的方劑制成外用多為膏劑，存在許多缺點，而噴膜劑能在皮膚、黏膜等處表面快速形成一層透氣性良好的可溶性生物薄膜，可以保護瘡面并且具有抗菌消炎的作用，且使用方便。本試驗根據多名研究者的相關資料進行試驗，制備出以1%的殼聚糖鹽酸鹽和3%的PVP－K30作為主要成膜材料，40%的乙醇為溶劑，3%的甘油作為增塑劑和0.1%薄荷腦作為促滲劑、219 mg/mL加味當歸四逆湯復方為處方的加味當歸四逆殼聚糖噴膜劑，并且制定質量標準保證每瓶總黃酮含量為1.83 mg/mL，為進一步研究成膜效果更佳且有活血化瘀作用的中藥復方噴膜劑提供參考。