張 璐,龔旭昊,董玲玲,戴 青,范 強(qiáng)

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

白頭翁口服液由白頭翁、黃連、秦皮、黃柏4味藥組成，具有清熱解毒，涼血止痢的功效[1]，市場上生產(chǎn)企業(yè)眾多。白頭翁口服液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2017年版中藥卷）。其中黃連及鹽酸小檗堿的薄層色譜鑒別中，黃連對照藥材提取過程較為復(fù)雜，且展開劑中含有致癌物苯，對人體傷害較大。處方中君藥黃連起主要藥效作用且價(jià)格較貴，為避免某些企業(yè)因節(jié)約成本不投、少投、投劣質(zhì)黃連，選擇黃連中關(guān)鍵指標(biāo)鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿為含量測定成分[2]，建立高效液相色譜法。通過對標(biāo)準(zhǔn)的有效提高，規(guī)范白頭翁口服液質(zhì)量，力求對動(dòng)物疫病防控起到積極的推動(dòng)作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2998 PDA檢測器，Empower色譜工作站軟件；電子分析天平:感量0.00001 g；KQ3200型超聲波清洗器；CAMAG REPROSTAR 3成像系統(tǒng)；雙槽展開缸；硅膠 G薄層板（10 cm×20 cm），批號(hào):20090803，購自煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所；乙腈，色譜純，購自默克公司；甲醇、鹽酸等試劑均為分析純，購自國藥化學(xué)試劑有限公司；水由實(shí)驗(yàn)室MILLIPORE超純水儀自制。

1.2 試藥 鹽酸小檗堿對照品（批號(hào)Z0221507），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；鹽酸巴馬汀對照品（批號(hào)110732－201812），購自中國食品藥品檢定研究院；黃連對照藥材（批號(hào)120913－201611），購自中國食品藥品檢定研究院。白頭翁口服液分別購自北京、山東等地。

2 薄層色譜法優(yōu)化研究

2.1 溶液的制備 供試品溶液:取本品1.5 mL，加甲醇10 mL，搖勻，作為供試品溶液。對照藥材溶液:取黃連對照藥材0.2 g，加甲醇10 mL，置水浴上加熱回流15 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液①；取黃連對照藥材0.2 g，加甲醇10 mL，超聲提取15 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液②。對照品溶液:取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2 試驗(yàn)方法 照薄層色譜法（《中國獸藥典》2015年版二部附錄0502）[3]試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，分別以苯－乙酸乙酯－甲醇 － 異丙醇 － 濃氨試液（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）（圖1）、環(huán)己烷－乙酸乙酯－甲醇－異丙醇－濃氨試液（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）（圖 2）、環(huán)己烷 － 乙酸乙酯 －異丙醇 －甲醇 －水 － 三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）（圖3）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.3 結(jié)果判斷 供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。三張色譜圖中（圖1～圖3），供試品在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.4 結(jié)果分析 黃連對照藥材采用回流提取法和超聲提取法所得到的薄層色譜圖完全一致，為簡便試驗(yàn)操作，可將回流提取優(yōu)化為超聲提取。三張色譜圖比較（圖1～圖3），展開劑環(huán)己烷－乙酸乙酯－異丙醇 －甲醇 － 水 － 三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）（圖3）斑點(diǎn)清晰，分離度較好，可替代原含苯的展開劑。方法對比見表1。

圖1 白頭翁口服液薄層色譜圖Fig 1 The layer chromatography of Baitouweng Oral Solution

圖2 白頭翁口服液薄層色譜圖Fig 2 The layer chromatography of Baitouweng Oral Solution

圖3 白頭翁口服液薄層色譜圖Fig 3 The layer chromatography of Baitouweng Oral Solution

表1 兩種薄層色譜法對比列表Tab 1 Comparison of these two thin layer chromatography

3 含量測定方法的建立及方法學(xué)考察

3.1 色譜條件 色譜柱 Agilent SB－C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相:乙腈－0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié) pH為4.0），檢測波長:347 nm，流速:1.0 mL/min，進(jìn)樣量:10 μL。

3.2 對照品溶液的制備 取鹽酸巴馬汀對照品約10 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸巴馬汀對照品儲(chǔ)備溶液；取鹽酸小檗堿對照品約10 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸小檗堿對照品儲(chǔ)備溶液。精密量取鹽酸巴馬汀對照品儲(chǔ)備溶液10 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸巴馬汀對照品溶液；精密量取鹽酸小檗堿對照品儲(chǔ)備溶液10 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸小檗堿對照品溶液。精密量取鹽酸巴馬汀對照品溶液、鹽酸小檗堿對照品溶液各25 mL，置100 mL量瓶中，作為混合對照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

3.3.1 提取溶劑考察 精密量取供試品溶液2 mL置50 mL量瓶中，分別加入甲醇、甲醇 －鹽酸（100∶1）的混合溶液適量，超聲 10 min，放置至室溫，分別加入甲醇、甲醇－鹽酸（100∶1）的混合溶液稀釋至刻度。以甲醇為提取溶劑的供試品與以甲醇－鹽酸（100∶1）的混合溶液為提取溶劑的供試品相比，鹽酸巴馬汀的峰面積為其88%，鹽酸小檗堿的峰面積為其85%。故選擇甲醇－鹽酸（100∶1）的混合溶液為供試品溶液的提取溶劑。

3.3.2 提取時(shí)間考察 精密量取供試品溶液2 mL置50 mL量瓶中，加入甲醇－鹽酸（100∶1）的混合溶液適量，分別不超聲直接稀釋至刻度、超聲10 min放置至室溫后稀釋至刻度、超聲20 min放置至室溫后稀釋至刻度、超聲30 min放置至室溫后稀釋至刻度，進(jìn)樣，測得的鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD值均小于1.8%，說明不超聲、超聲10 min、超聲20 min、超聲30 min提取效率相同。為確保供試品溶液混合均勻，兼顧檢驗(yàn)效率，最終選擇超聲10 min作為供試品提取方式。

3.3.3 供試品溶液制備方法建立 精密量取供試品2 mL，置50 mL量瓶中，加入甲醇 －鹽酸（100∶1）的混合溶液適量，超聲10 min，放置至室溫，加甲醇－鹽酸（100∶1）的混合溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

3.3.4 自制供試品溶液的制備 實(shí)驗(yàn)室照白頭翁口服液制法自制，即取白頭翁30 g、黃連15 g、秦皮30 g、黃柏22.5 g，每次加水100 mL煎煮，煎煮3次，合并煎液，濾過，濾液加入乙醇，使含醇量達(dá)到75%，靜置12 h，濾取上清液回收乙醇，加水調(diào)至97.5 mL，即得。

3.3.5 陰性供試品溶液的制備 處方中不加黃連、黃柏，其他同白頭翁口服液制法，即取白頭翁30 g、秦皮30 g，每次加水100 mL煎煮，煎煮3次，合并煎液，濾過，濾液加入乙醇，使含醇量達(dá)到75%，靜置12 h，濾取上清液回收乙醇，加水調(diào)至97.5 mL，作為陰性供試品溶液。

3.4 含量測定方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

3.4.1 檢測波長的選擇 照“3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣混合對照品溶液和供試品溶液，所得紫外吸收光譜圖見圖4。綜合《中國獸藥典》2015年版二部中黃連含量測定項(xiàng)下345 nm的檢測波長，選擇347 nm作為白頭翁口服液含量測定的測定波長。

3.4.2 純度檢查 照“3.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“3.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣檢測。測得鹽酸巴馬汀峰的純度角度為0.196，純度閾值為0.276，純度角度＜純度閾值；測得鹽酸小檗堿峰的純度角度為0.105，純度閾值為0.241，純度角度＜純度閾值。純度檢查符合要求。

3.4.3 專屬性試驗(yàn) 分別吸取陰性供試品溶液、鹽酸巴馬汀對照品溶液、鹽酸小檗堿對照品溶液、自制供試品溶液各10μL，照“3.1”項(xiàng)下色譜條件測定，鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿與相應(yīng)的對照品色譜峰保留時(shí)間一致，達(dá)到基線分離。陰性供試品溶液色譜中與鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰相應(yīng)的保留時(shí)間處無吸收峰，表明制劑中其他成分對測定無干擾，見圖5。

圖4 紫外吸收光譜圖Fig 4 The ultraviolet absorption spectrum

圖5 高效液相色譜圖Fig 5 The high performance liquid chromatogram

3.4.4 線性關(guān)系考察 精密量取鹽酸巴馬汀對照品儲(chǔ)備溶液、鹽酸小檗堿對照品儲(chǔ)備溶液及鹽酸巴馬汀對照品溶液、鹽酸小檗堿對照品溶液適量，置量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.16、0.5、5、10、20、40、80 μg/mL 的混合對照品溶液，濾過，分別進(jìn)樣10μL，測定。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿回歸方程（n＝7）:Y＝ 75500.38X＋4888.63，r＝1.00；Y＝68437.27X＋2263.89，r＝1.00。 結(jié)果表明，鹽酸巴馬汀在0.16～80μg/mL、鹽酸小檗堿在0.16～80μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與溶液濃度線性關(guān)系良好，見圖6、圖7。

圖6 鹽酸巴馬汀線性關(guān)系圖Fig 6 Linear relationship diagram of Palmatine hydrochloride

圖7 鹽酸小檗堿線性關(guān)系圖Fig 7 Linear relationship diagram of Berberine hydrochloride

3.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取自制供試品，照“3.3.3”項(xiàng)下方法配制6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿平均含量分別為 167.22、315.43μg/mL，RSD分別為0.47%、0.58%，表明方法重復(fù)性良好。

3.4.6 精密度試驗(yàn) 取“3.2”項(xiàng)下的混合對照品溶液，照“3.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并計(jì)算RSD值。鹽酸巴馬汀、鹽酸特比萘芬的RSD分別為0.16%、0.15%，表明方法精密度良好。

3.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“3.2”項(xiàng)下的混合對照品溶液，分別在0、6、12、24 h 各進(jìn)樣 10 μL，測定鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的峰面積，其RSD分別為1.65%、1.74%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

3.4.8 定量限與檢出限 精密吸取“3.2”項(xiàng)下混合對照品溶液逐步稀釋，取稀釋后溶液進(jìn)樣檢測。按照10倍噪音計(jì)算最低定量限濃度，鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的最低定量限濃度均為0.16μg/mL；按照3倍噪音計(jì)算最低檢出限濃度，鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的最低檢出限濃度均為0.12μg/mL。

3.4.9 回收率試驗(yàn) 白頭翁口服液中鹽酸巴馬汀的量為 167.22μg/mL，鹽酸小檗堿的量為315.43μg/mL。分別按照三個(gè)添加量添加對照品，鹽酸巴馬汀添加量為272.40、325.92、397.44μg，鹽酸小檗堿添加量為503.50、634.80、759.00μg，每個(gè)添加量平行三份，照“3.3.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，照“3.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加標(biāo)回收率（表2）。其中，鹽酸巴馬汀的回收率在99.22% ～102.27%之間，平均回收率為100.93%，RSD值為0.96%；鹽酸小檗堿的回收率在99.86% ～102.97之間，平均回收率為101.45%，RSD值為1.07%。上述試驗(yàn)結(jié)果表明該方法回收率高。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)表Tab 2 Sample recovery rate test results

3.4.10 耐用性試驗(yàn)

3.4.10.1 色譜柱類型考察 取白頭翁口服液供試品溶液，考察Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、資生堂MGⅡC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）、資生堂MGⅡC18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）對兩種成分保留時(shí)間、分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)的影響。結(jié)果見表3。根據(jù)色譜柱類型考察結(jié)果可以看出，在四種類型的色譜柱上，兩成分峰的理論板數(shù)均大于9000。參考《中國獸藥典》2015年版二部黃連含量測定方法，規(guī)定本含量測定方法理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

表3 色譜柱類型考察Tab 3 Investigation of Column type

3.4.10.2 流動(dòng)相比例、pH值、色譜柱溫度考察取白頭翁口服液供試品溶液，改變流動(dòng)相【乙腈－0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0）】的比例分別為52∶48；50∶50；48∶52 進(jìn)行測定；改變流動(dòng)相pH值分別為3.8、4.0、4.2進(jìn)行測定；改變色譜柱柱溫分別為25℃、30℃、35℃進(jìn)行測定，鹽酸巴馬汀峰與鹽酸小檗堿峰的分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)均符合要求，上述試驗(yàn)結(jié)果表明該方法耐用性良好。試驗(yàn)結(jié)果見表4～表6。

表4 流動(dòng)相比例考察Tab 4 Investigation of flow phase proportion

表5 流動(dòng)相pH考察Tab 5 Investigation of pH of flow phase proportion

表6 色譜柱溫度考察Tab 6 Investigation of Column temperature

4 討論與結(jié)論

4.1 含量限度的確定 參照《中國獸藥典》2015年版二部黃連、黃柏含量測定方法分別對黃連、黃柏中鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量進(jìn)行測定。黃連藥材中鹽酸巴馬汀含量為33.08 mg/g，黃連藥材中鹽酸小檗堿含量為126.40 mg/g；黃柏藥材中鹽酸小檗堿含量為103.04 mg/g。自制白頭翁口服液中，鹽酸巴馬汀含量為4.68 mg/g，鹽酸小檗堿含量為4.58 mg/g。計(jì)算可得鹽酸巴馬汀轉(zhuǎn)移率為14.15%，鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率為4.07%。

照《中國獸藥典》2015年版二部中黃連、黃柏中鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿最低含量，結(jié)合轉(zhuǎn)移率，計(jì)算得到白頭翁口服液中鹽酸巴馬汀含量應(yīng)不低于0.33 mg/mL，鹽酸小檗堿含量應(yīng)不低于0.63 mg/mL?？紤]到藥廠大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)移率低于實(shí)驗(yàn)室小試轉(zhuǎn)移率，結(jié)合市售樣品情況，將含量限度降低20%，含量限度擬定為:白頭翁口服液每1 mL含黃連、黃柏以鹽酸小檗堿（C20H18ClNO4）計(jì)，不得少于0.50 mg；每1 mL含黃連以鹽酸巴馬汀（C21H22ClNO4）計(jì)，不得少于0.26 mg。

4.2 市售白頭翁口服液樣品質(zhì)量評(píng)價(jià) 取按原標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格的7個(gè)廠家，共9批白頭翁口服液，照優(yōu)化后的薄層色譜法及新建立的高效液相色譜法進(jìn)行檢驗(yàn)。薄層色譜法結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，結(jié)果與原標(biāo)準(zhǔn)一致。高效液相色譜法結(jié)果表明，僅有3批白頭翁口服液中鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量符合要求，合格率為33%。這表明，部分生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)白頭翁口服液過程中存在少投黃連或使用劣質(zhì)黃連進(jìn)行藥物生產(chǎn)的現(xiàn)象，白頭翁口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高可對此類現(xiàn)象進(jìn)行有效打擊。