侯惠靜，吳子健，石振鵬，姜宇峰

（1.天津天獅學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，天津301700；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

雞卵類(lèi)黏蛋白（hen-egg ovomucoid，HOVM）是一種雞蛋卵清蛋白（分子量為28 kDa），是典型的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有3個(gè)相互對(duì)立的同源Kazal結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域約含有60個(gè)氨基酸殘基以及3個(gè)域內(nèi)二硫鍵[1]，可有效抑制胰蛋白酶的活力，其抑制β-牛胰蛋白酶的主要活性位點(diǎn)位于第二結(jié)構(gòu)域上，HOVM是單頭胰蛋白酶抑制劑（single-headed trypsin inhibitor），1分子HOVM只能抑制1分子的胰蛋白酶[2-3]。

HOVM分子不僅含有蛋白部分，還含有約20%～25%的糖基部分[4]，有3類(lèi)五觸角雜合型的N-連接寡糖基團(tuán)參與了糖基的構(gòu)成，這些寡糖基團(tuán)以含3個(gè)甘露糖的五糖殘基（Manα1→6（Manα1→3）Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc）為核心，單糖殘基主要包括N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖、半乳糖以及唾液酸等；寡糖基團(tuán)與蛋白部分的鏈接位點(diǎn)位置都具有Asn-XThr/Ser 序列[5]，分別位于 Asn10、Asn53、Asn69、Asn75以及Asn175[4]。

HOVM可用于純化胰蛋白酶的親和柱的配基，但如何調(diào)整利用其與胰蛋白酶之間的結(jié)合對(duì)于親和柱的開(kāi)發(fā)制備具有很重要的意義，同時(shí)HOVM上糖基含量與其抑制胰蛋白酶活性之間的關(guān)系對(duì)于研究HOVM的胰蛋白酶抑制作用也有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料

胰蛋白酶250 U/mg、N-苯甲?；?L-精氨酸乙酯鹽酸鹽（Nα-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride BAEE）、8-苯氨基-1-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、β-甘露糖苷酶：Sigma公司。

1.1.2 儀器

3-18k離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；FDU-810型EYELA冷凍干燥機(jī)：日本東京理化公司；UV-2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀：美國(guó)尼高力儀器公司；MOS-450/AF-CD圓二色譜儀：法國(guó)Biologic公司。

1.2 方法

1.2.1 雞卵類(lèi)黏蛋白的制備工藝

HOVM的分離與純化按照吳子健等的方法[6]進(jìn)行，具體方法為：手工分離得到的雞蛋清與去離子水按體積比1∶1混合降低黏度，然后加入2倍體積的10%三氯乙酸溶液混合均勻后，用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至3.5，0～4℃下靜置過(guò)夜，離心后所得上清于4℃下透析過(guò)夜除去三氯乙酸，然后再進(jìn)行硫酸銨（硫酸銨飽和度為50%）鹽析，所得的上清中的硫酸銨飽和度再調(diào)至80%，靜置24 h，離心，得到的沉淀透析除鹽后凍干，就得到了HOVM樣品。

1.2.2 β-甘露糖苷酶酶切處理HOVM[7-9]

HOVM蛋白用β-甘露糖糖苷酶進(jìn)行酶解處理，具體方法如下：20 mg/mL HOVM蛋白溶液（100 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH5.5），分別按比例加入3.75 U/100 mg、7.50 U/100 mg、15.00 U/100 mg 的 β-甘露糖苷酶于37℃下反應(yīng)，空白組為不加β-甘露糖苷酶的20 mg/mL HOVM溶液。酶解后立即用冰浴冷卻至4℃，然后加入無(wú)水硫酸銨至飽和度為40%，4℃下靜置6 h后，離心（4℃，4 000×g）15 min后取上清；上清液中繼續(xù)添加無(wú)水硫酸銨至飽和度為80%，4℃下靜置6 h后，離心（4℃，4 000×g）15 min取沉淀得到經(jīng)糖苷酶酶解的HOVM蛋白，再經(jīng)透析除硫酸銨后進(jìn)行真空冷凍干燥。

1.2.3 總糖的測(cè)定

總糖的測(cè)定按照苯酚-硫酸法測(cè)定。

1.2.4 圓二色譜法

按照Yamamoto等[10]的方法進(jìn)行圓二色譜（circular dichroism，CD）檢測(cè)及分析，具體操作步驟為：0.2 mg/mL蛋白樣品溶液（10 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4）。圓二色譜的參數(shù)為：光徑為1.0 cm、掃描波長(zhǎng)范圍190 nm～250 nm、帶寬1.0 nm、掃描速率60 nm/min。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量利用DichroWeb程序（http：//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml）在線分析。

1.2.5 蛋白表面疏水性的測(cè)定

蛋白表面疏水性的測(cè)定按照Ruan等[11]的方法，以ANS作為外源性熒光探針，2 mL 500 μg/mL HOVM樣品液（10 mmol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液，pH7.4）加入10 μL ANS溶液（5.0 mmol/L），于20℃下避光孵育1.0 h，然后掃描測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)在400 nm～700 nn范圍內(nèi)蛋白樣品的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為380 nm，狹縫校正寬度為5 nm，掃描速率為1 200 nm/min。

1.2.6 胰蛋白酶抑制率的測(cè)定[12]

胰蛋白酶活性測(cè)定加樣見(jiàn)表1。

表1胰蛋白酶活性測(cè)定加樣表Table 1 Sample application table for trypsinase activity determination

按照表1所示加樣并檢測(cè)，每隔30 s讀A253nm的數(shù)值并記錄，計(jì)時(shí)5 min，計(jì)算胰蛋白酶活性。

一個(gè)胰蛋白酶活力單位定義為：以BAEE為底物，pH 7.6，溫度25℃，反應(yīng)體積3.2 mL胰蛋白酶酶解BAEE每分鐘產(chǎn)生0.001單位的A253nm變化。

式中：A0為反應(yīng)初測(cè)得的光吸收變化值；A1為反應(yīng)5 min后測(cè)得的光吸收變化值；A2為不加HOVM時(shí)得到的光吸收變化值；A3為加HOVM時(shí)得到的光吸收變化值。

1.2.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

3次重復(fù)試驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)處理以及顯著性分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，利用軟件origin8.8進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-甘露糖苷酶酶解對(duì)HOVM中糖基含量的影響HOVM經(jīng)過(guò)β-甘露糖苷酶酶切處理后，HOVM

蛋白中所含糖基的含量變化如圖1所示。

圖1 β-甘露糖苷酶酶切處理對(duì)HOVM中糖基含量的影響Fig.1 Effects of enzymolysis by β-mannosidase on contents of sugar group in HOVM

通常雞卵清中的HOVM蛋白約含20%～25%的糖基，其中第三個(gè)結(jié)構(gòu)域中的Asn175若未糖基化，則HOVM中的糖基含量為20%，而本研究中的對(duì)照組（Control組）的糖基含量為20%，可能是由于其一級(jí)結(jié)構(gòu)中的Asn175未被糖基化。圖1的結(jié)果表明：酶解時(shí)間延長(zhǎng)和酶活力單位添加的增大是有利于糖苷酶酶切HOVM中糖基的效果；HOVM所含糖基中甘露糖殘基約占6.50%～8.50%，當(dāng)用β-甘露糖苷酶酶解處理HOVM，當(dāng)兩者按15.00 U/100 mg混合時(shí)，酶解48 h后，HOVM上的糖基含量趨于穩(wěn)定，此時(shí)HOVM上剩余糖基含量約為11.18%。

2.2 β-甘露糖苷酶酶解對(duì)HOVM表面疏水性的影響

通常水溶性蛋白表面的氨基酸殘基為親水性氨基酸殘基，而帶有疏水側(cè)鏈的氨基酸殘基常處于分子核心內(nèi)部。表面疏水性是蛋白質(zhì)的重要特性之一，通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)表面疏水性的變化可以監(jiān)控蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[13]。酶底比為15Uβ-甘露糖苷酶/100 mg HOVM條件下，β-甘露糖苷酶酶解HOVM后，利用疏水探針ANS，激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)400 nm～700 nn范圍熒光發(fā)射光譜，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 β-甘露糖苷酶酶解對(duì)HOVM蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effects of enzymolysis by β-mannosidase on surface hydrophobicity of HOVM

相對(duì)與未進(jìn)行酶處理的HOVM來(lái)說(shuō)，β-甘露糖苷酶酶解后的HOVM的最大發(fā)射波長(zhǎng)幾乎沒(méi)有出現(xiàn)紅移或藍(lán)移，但熒光強(qiáng)度增大了，表明β-甘露糖苷酶酶解提高了HOVM蛋白表明疏水性，可能的原因在于：其一、HOVM中的糖基含量較高，而且每個(gè)糖基化位點(diǎn)上的寡糖鏈為雜合型的N-鏈接糖鏈，五糖核心又延伸出5個(gè)支鏈，這些寡糖鏈多處于HOVM空間結(jié)果的表面，會(huì)在空間上掩蔽蛋白中一部分疏水性氨基酸殘基，但當(dāng)這些寡糖鏈上的糖殘基被酶切下來(lái)脫離了蛋白部分，那么原本被掩蔽的疏水性部分就會(huì)被暴露出來(lái)，從而使得被酶切去部分糖基的HOVM與疏水性ANS熒光探針的結(jié)合能力提高；其二、寡糖基團(tuán)含有親水性的羥基，當(dāng)糖殘基從蛋白質(zhì)上脫離開(kāi)來(lái)，勢(shì)必也會(huì)使親水性減弱。

2.3 β-甘露糖苷酶酶解對(duì)HOVM胰蛋白酶抑制率的影響

酶底比為15Uβ-甘露糖苷酶/100 mgHOVM，酶解處理時(shí)間（12、24、36、48、60 h），HOVM 上糖基含量與酶解后HOVM對(duì)胰蛋白酶酶活力抑制率之間的關(guān)系如圖3所示。

圖3 β-甘露糖苷酶酶解對(duì)HOVM胰蛋白酶抑制率的影響Fig.3 Effects of enzymolysis by β-mannosidase on HOVM trypsin inhibition rate

隨著β-甘露糖苷酶酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，HOVM蛋白上的糖基含量是下降的，而HOVM對(duì)胰蛋白酶抑制率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)酶解36 h后，HOVM胰蛋白酶抑制率達(dá)到90.4%，基本達(dá)到最高程度，48 h以及60 h，HOVM胰蛋白酶抑制率基本不再變化，也就是HOVM上寡糖基團(tuán)含量的減少會(huì)提高其對(duì)胰蛋白酶的抑制率。其可能的原因在于：HOVM是典型的Kazal型蛋白酶抑制劑，HOVM的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是直接與胰蛋白酶接觸作用，該結(jié)構(gòu)域上的Arg89的側(cè)鏈會(huì)深入到胰蛋白S1腔內(nèi)，除此之外，包括這個(gè)Arg89總共有12個(gè)與蛋白酶接觸的氨基酸殘基[14]，寡糖糖基會(huì)影響這些位點(diǎn)與蛋白酶的接觸作用，但當(dāng)這些寡糖基團(tuán)被水解處理下來(lái)后，其空間位阻會(huì)減少，也就是第二結(jié)構(gòu)域與胰蛋白酶接觸的可能性會(huì)增大，其抑制酶活力的效果會(huì)提高。

2.4 β-甘露糖苷酶酶解對(duì)HOVM二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

β-甘露糖苷酶處理后的HOVM按照濃度0.5mg/mL溶于磷酸鹽緩沖液中，其圓二色譜圖及其二級(jí)結(jié)構(gòu)組成分析如圖4所示。

在溶液狀態(tài)下，HOVM各二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化范圍較紅外表征的結(jié)果小：α-螺旋為34.4%～35.2%、β-折疊為 10.6%～11.1%、β-轉(zhuǎn)角為 22.7%～23.3%、無(wú)規(guī)則卷曲為30.9%～32.5%。通過(guò)CD的表征表明：糖苷酶酶切處理對(duì)HOVM規(guī)正的二級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋和β-折疊）以及β-轉(zhuǎn)角的組成的影響較小，可能的原因在于HOVM的蛋白質(zhì)部分含3個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，且每個(gè)結(jié)構(gòu)域均3個(gè)二硫鍵，極大地限制了構(gòu)象變化以及維系著其天然構(gòu)象的穩(wěn)定性，這一點(diǎn)與2013年Sara Benedé等[15]的CD表征結(jié)果相一致。但是不同的是，β-甘露糖苷酶處理會(huì)降低其二級(jí)結(jié)構(gòu)組成中無(wú)規(guī)則卷曲的組成，無(wú)規(guī)則卷曲的組成由32.5%降低到了30.9%。

圖4 β-甘露糖苷酶酶解后HOVM二級(jí)結(jié)構(gòu)組成的CD光譜分析Fig.4 Secondary structure composition analysis of post-βmannosidase-digestion HOVM by circular dichroism

2.5 β-甘露糖苷酶酶解對(duì)HOVM各個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成的影響

酶底比為5.0Uβ-甘露糖苷酶/100 mg HOVM底物條件下，經(jīng)過(guò)酶解處理后，HOVM蛋白上的各個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成與其胰蛋白酶抑制活性之間的變化關(guān)系如圖5所示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行了顯著性分析，如表1所示。

結(jié)果表明：經(jīng)β-甘露糖苷酶酶解處理，HOVM對(duì)胰蛋白酶抑制活性的變化與該蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲含量的變化呈顯著相關(guān)性（p＜0.01），而與其它二級(jí)結(jié)構(gòu)組成含量的變化無(wú)相關(guān)性；在12 h～60 h時(shí)間范圍內(nèi)，隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，HOVM對(duì)胰蛋白酶抑制率會(huì)提高，而無(wú)規(guī)則卷曲的含量下降。其可能的原因在于：β-甘露糖苷酶酶解處理降低了HOVM分子寡糖基團(tuán)含量，一方面會(huì)使HOVM分子中原本受寡糖基團(tuán)空間掩蔽的含疏水性基團(tuán)的氨基酸殘基被暴露出來(lái)，而這些失去掩蔽的疏水性基團(tuán)是無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間暴露在蛋白質(zhì)親水性表面的，它們彼此之間會(huì)發(fā)生疏水相互作用，進(jìn)而HOVM局部結(jié)構(gòu)做微小調(diào)節(jié)；另一方面，原本的無(wú)規(guī)則卷曲主要是由含有親水性基團(tuán)的氨基酸殘基組成，分布于水溶性蛋白質(zhì)的表面，而蛋白質(zhì)中的寡糖基團(tuán)中的羥基會(huì)與無(wú)規(guī)則卷曲中氨基酸殘基側(cè)鏈的親水性基團(tuán)形成氫鍵，而寡糖基團(tuán)被酶解去除后，原有的氫鍵消除，而新的氫鍵會(huì)形成，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生改變，原本某些無(wú)規(guī)則卷曲的部分可能會(huì)變成規(guī)正或部分規(guī)正的二級(jí)結(jié)構(gòu)。但更深層次的原因還需要進(jìn)一步探討。

圖5 β-甘露糖苷酶處理后HOVM各二級(jí)結(jié)構(gòu)組成與胰蛋白酶抑制率Fig.5 Variation of HOVM’s secondary structure component and trypsin inhibition rate after β-mannosidase treatment

表2 β-甘露糖苷酶處理后HOVM二級(jí)結(jié)構(gòu)組成與其胰蛋白酶抑制率之間的相關(guān)性分析Table 2 Analysis of the correlation between secondary structure component variation of HOVM and trypsin inhibitory rate following β-mannosidase treatment

3 結(jié)論

經(jīng)β-甘露糖苷酶酶解處理，隨著酶解時(shí)間（12、24、36、48、60 h）的延長(zhǎng)，HOVM上寡糖基團(tuán)含量由20%降低至11.8%并且不再降低；隨著寡糖基團(tuán)含量的降低，HOVM蛋白的疏水性提高；蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲的含量由32.5%降低至30.9%，同時(shí)胰蛋白酶的抑制率由84.9%逐漸增高至90.1%，且兩者之間的變化具有極其顯著的相關(guān)性。