牛彪，梁妍，梁劍平，劉宇

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730050）

茶樹油（tea tree oil，TTO）也稱互葉白千層油，從桃金娘科互葉白千層樹的葉和嫩枝中利用水蒸氣蒸餾法提取得到的一種無(wú)色至淡黃色油狀液體，具有怡人的芳香氣味。屬白千層萜品型香料油，具有良好的殺菌抑菌及保健作用。原產(chǎn)于澳大利亞的新南威爾士州和新西蘭的部分地區(qū)[1]。中國(guó)自20世紀(jì)90年代開始，先由廣東、廣西、海南、福建、云南等地開始引種，并形成一定的種植規(guī)模，茶樹精油具有良好的廣譜殺菌抑菌及保健作用，可抗病毒[2]、抗菌[3-4]、激活免疫因子[5]、抗寄生蟲[6]、抗氧化防腐促進(jìn)傷口愈合[7]，是一種可替代抗生素的優(yōu)良天然抗菌劑，無(wú)毒無(wú)公害[8]。

分子蒸餾技術(shù)[9]（molecular distillation）是一種特殊的液——液分離技術(shù)，通過不同物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)平均自由程的不同而實(shí)現(xiàn)分離，這和傳統(tǒng)蒸餾技術(shù)借助沸點(diǎn)不同實(shí)現(xiàn)分離完全不同，該技術(shù)運(yùn)用導(dǎo)熱油控制溫度，在一定的溫度下，混合物被加熱后，有一部分輕分子運(yùn)動(dòng)大于平均自由程后被冷凝后收集至輕組分收集瓶，重組分未被冷凝流入重組分收集瓶。從而達(dá)到分離的目的。本文主要從影響分子蒸餾的4個(gè)關(guān)鍵因素出發(fā)，即蒸餾溫度、進(jìn)樣速率、刮膜器轉(zhuǎn)速、蒸餾壓力，以期對(duì)茶樹油工業(yè)化利用、生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樹油：天津中澳嘉喜諾生物科技有限公司；松油烯-4-醇對(duì)照品：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；1，8-桉葉素對(duì)照品：上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；正己烷（色譜級(jí)）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；導(dǎo)熱油（二甲基硅油）、泵油：北京四方物料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FMD-60刮膜式分子蒸餾裝置：杜馬斯儀器（上海）有限公司；Aligent 7890A毛細(xì)管氣相色譜儀、氫火焰離子檢測(cè)器（FID）：美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；BT25S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

本試驗(yàn)采取單因素研究方法，對(duì)每一餾分運(yùn)用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定，得到松油烯-4-醇、1，8-桉葉素相對(duì)含量，再結(jié)合正交試驗(yàn)得到松油烯-4-醇、1，8-桉葉素的最佳工藝參數(shù)。

1.3.1 單因素考察[10]

根據(jù)相關(guān)資料顯示，分子蒸餾法富集茶樹油中特征成分與蒸餾溫度、進(jìn)料速率、刮膜器轉(zhuǎn)速、蒸餾壓力有關(guān)，因此，首先通過單因素試驗(yàn)來(lái)考察茶樹油的富集工藝。

1.3.1.1 蒸餾溫度的考察

用量筒準(zhǔn)確量取茶樹油20mL，從進(jìn)料口加入，在蒸餾壓力100 Pa，進(jìn)料速率1 mL/min，刮膜轉(zhuǎn)速360 r/min條件下，考察蒸餾溫度的變化對(duì)茶樹油中特征成分含量的影響。其中，溫度由高溫循環(huán)系統(tǒng)通過導(dǎo)熱油控制，冷凝裝置采用低溫循環(huán)系統(tǒng)冷卻水控制。

1.3.1.2 蒸餾壓力的考察

在蒸餾溫度46℃，進(jìn)料速率1 mL/min，刮膜轉(zhuǎn)速360 r/min條件下，考察蒸餾壓力的變化對(duì)茶樹油中特征組分含量的影響。

1.3.1.3 進(jìn)料速率的考察

在蒸餾溫度46℃，蒸餾壓力100 Pa，刮膜轉(zhuǎn)速360 r/min條件下，考察進(jìn)料速率的變化對(duì)茶樹油中特征組分含量的影響。

1.3.1.4 刮膜轉(zhuǎn)速的考察

在蒸餾溫度46℃，蒸餾壓力100 Pa，進(jìn)料速率1 mL/min條件下，考察刮膜轉(zhuǎn)速的變化對(duì)茶樹油中特征組分含量的影響。

1.3.2 氣相色譜對(duì)特征組分的測(cè)定

1.3.2.1 氣相色譜條件[11]

毛細(xì)管色譜柱Aligent DB-FFAP（30 m×0.32 mm，0.5 μm），F(xiàn)ID 檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度 240℃，檢測(cè)器溫度240℃，進(jìn)樣量 1 μL，柱溫從 50℃起，保持 1 min，以5℃/min的速率升至200℃，保持2 min，分流比50∶1，氣體流速1.3 mL/min，恒線流速，載氣為氮?dú)狻?/p>

1.3.2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取1，8-桉葉素對(duì)照品 5μL（4.1mg）、松油烯-4-醇對(duì)照品 60 μL（55.75 mg），將兩者置于同一 10 mL容量瓶，用正己烷定容至刻度，搖勻，得1，8-桉葉素濃度為0.41 mg/mL，松油烯-4-醇濃度為5.575 mg/mL。

1.3.2.3 供試品溶液配制

精密稱取茶樹油樣品75 μL（71.3 mg）用正己烷定容至10 mL容量瓶；精密稱取單因素條件下各餾分輕、重組分60 μL定容于10 mL容量瓶，搖勻，即得。

1.3.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“1.3.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，用倍比稀釋法稀釋成6個(gè)濃度。分別取以上濃度對(duì)照品1 μL注入氣相色譜儀，以色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過氣相外標(biāo)法得出各餾分中特征組分（1，8-桉葉素、松油烯-4-醇）的含量。

1.3.2.5 特征組分含量的測(cè)定

取“1.3.2.2”項(xiàng)供試品溶液 1 μL 按“1.3.2.1”項(xiàng)氣相色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，按“1.3.2.4”及公式（1）得出結(jié)論：

式中：c為特征組分的濃度，mg/mL；v為定容的體積數(shù)，mL；M為供試品的質(zhì)量，mg；m為相對(duì)含量。

1.3.2.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合1，8-桉葉素、松油烯-4-醇蒸餾得率，選擇對(duì)1，8-桉葉素、松油烯-4-醇影響較大的蒸餾溫度、蒸餾壓力、進(jìn)料速率及刮膜轉(zhuǎn)速為正交因素，設(shè)定3個(gè)水平，以特征組分的相對(duì)含量為考察指標(biāo)，建立L9（34）正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)茶樹油輕、重組分質(zhì)量的考察結(jié)果

2.1.1 蒸餾溫度對(duì)組分含量的影響

蒸餾溫度對(duì)組分含量的影響見圖1。

圖1 蒸餾溫度對(duì)組分含量的影響Fig.1 Effect of distillation temperature on component content

從圖1中可以看出，輕組分呈現(xiàn)先增后降再增加的趨勢(shì)，重組分卻一直在降低。這可能因?yàn)樵谳^低溫度下，茶樹油中少部分輕分子在刮膜轉(zhuǎn)速作用下先溢出進(jìn)入輕組分，此時(shí)溫度未達(dá)到汽化溫度，輕、重組分未完全分離，隨著溫度的升高，茶樹油被汽化進(jìn)入輕組分，質(zhì)量迅速增加直至穩(wěn)定，重組分由于輕組分的溢出出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。

2.1.2 蒸餾壓力對(duì)組分含量的影響

蒸餾壓力對(duì)組分含量的影響見圖2。

圖2 蒸餾壓力對(duì)組分含量的影響Fig.2 Effect of distillation pressure on component content

從圖2中得出，壓力在40 Pa～110 Pa時(shí)，輕組分含量逐漸降低，重組分含量勻速升高，之后兩者均緩慢降低，這是因?yàn)樵?6℃時(shí)，茶樹油中大多數(shù)輕分子已進(jìn)入輕相，隨著蒸餾壓力的升高，輕分子不能被汽化而進(jìn)入輕相，只能保留在重相。

2.1.3 進(jìn)料速率對(duì)組分含量的影響

進(jìn)料速率對(duì)組分含量的影響見圖3。

圖3 進(jìn)料速率對(duì)組分含量的影響Fig.3 Effect of feed rate on component content

從圖3中可看出，輕組分含量呈先升高再降低后升高的趨勢(shì)，重組分含量呈先緩慢降低再升高的趨勢(shì)。因?yàn)樵谳^低進(jìn)料速率（小于1 mL/min）時(shí)，輕組分汽化進(jìn)入輕相，而當(dāng)進(jìn)料速率逐漸增大時(shí)，輕組分不能完全被汽化只能再進(jìn)入重相，呈現(xiàn)出重組分含量升高的趨勢(shì)。因此，要將輕重組分很好地分離開，且易揮發(fā)的茶樹油蒸餾時(shí)間過短或過長(zhǎng)都會(huì)影響各組分的成分。

2.1.4 刮膜轉(zhuǎn)速對(duì)組分含量的影響

刮膜轉(zhuǎn)速對(duì)組分含量的影響見圖4。

圖4 刮膜轉(zhuǎn)速對(duì)組分含量的影響Fig.4 Effect of scraping speed on component content

從圖4中可以得出：輕組分含量出現(xiàn)先降低后增高的趨勢(shì)，重組分含量則逐漸升高直至保持穩(wěn)定。由于刮膜轉(zhuǎn)速越大，分子之間的平均自由程相對(duì)增大，致使大部分分子運(yùn)動(dòng)小于平均自由程而進(jìn)入重相，使得重組分含量逐漸升高，輕組分含量降低，當(dāng)轉(zhuǎn)速大于360 r/min時(shí)一部分重分子被刮膜后變成了輕分子，使得輕分子含量開始小幅度升高。

2.2 線性關(guān)系考察結(jié)果

按“1.3.2.3”中的相關(guān)內(nèi)容，得出相關(guān)線性關(guān)系及氣相圖譜，見圖5～圖8。

圖5 1，8-桉葉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 1，8-cineole standard curve

圖6 松油烯-4-醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.6 Terpinene-4-ol standard curve

由圖5～圖8得到：1，8-桉葉素回歸方程為：A=439.21C-0.256 8，r2=0.999 98，松油烯-4-醇回歸方程為：A=337.653C-3.751，r2=0.999 93?？梢?1，8-桉葉素在0.012 977 mg/mL～0.410 960 mg/mL與峰面積之間具有良好的線性關(guān)系，松油烯-4-醇在0.181 451 mg/mL～5.600 60 mg/mL與峰面積之間具有良好的線性關(guān)系。

圖7 茶樹油對(duì)照品色譜圖Fig.7 Tea tree oil reference chromatogram

圖8 茶樹油樣品色譜圖Fig.8 Tea tree oil sample chromatograms

2.3 特征成分含量測(cè)定結(jié)果

按照“1.3.2.5”的內(nèi)容測(cè)得茶樹油中1，8-桉葉素和松油烯-4-醇的相對(duì)含量，結(jié)果見表1。

表1 茶樹油中特征組分含量測(cè)定Table 1 Determination of characteristic components in Tea Tree Oil

2.4 單因素條件下各餾分中特征組分的含量

各單因素條件下輕組分及重組分中特征成分的含量，其具體結(jié)果分別見表2～表5。

從表2可以看出，輕組分中含有的1，8-桉葉素含量明顯高于重組分，但松油烯-4-醇含量卻相反，輕組分1，8-桉葉素相對(duì)含量隨溫度升高呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，且在38℃時(shí)達(dá)到最大3.70%，但結(jié)合圖1，38℃時(shí)分離得到的輕組分卻很少，46℃時(shí)分離得到的輕、重組分相對(duì)較多，且輕組分中1，8-桉葉素的相對(duì)含量較多，達(dá)到3.66%；松油烯-4-醇的相對(duì)含量在重組分中隨溫度的升高呈現(xiàn)先增后降的走勢(shì)，且在46℃時(shí)達(dá)到了最大56.03%。因此，選擇46℃為1，8-桉葉素、松油烯-4-醇正交試驗(yàn)考察點(diǎn)。

表2 不同蒸餾溫度下各組分特征成分含量Table 2 Characteristic composition of each component at different distillation temperatures

表3 不同蒸餾壓力下各組分特征成分含量Table 3 Characteristic composition of each component at different distillation pressure

表4 不同進(jìn)料速率下各組分特征成分含量Table 4 Characteristic composition of each component at different feed rate

從表3可以看出，輕組分中含有的1，8-桉葉素含量明顯高于重組分，但松油烯-4-醇含量卻相反，輕組分1，8-桉葉素相對(duì)含量隨壓力增加呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，且在110 Pa時(shí)達(dá)到最大4.10%；松油烯-4-醇相對(duì)含量在重組分中隨壓力增加呈現(xiàn)先增后降的走勢(shì)，且在110Pa時(shí)達(dá)到了最大55.45%。結(jié)合圖2，在110Pa時(shí)分離得到的兩者都較多。因此，選擇110 Pa為1，8-桉葉素、松油烯-4-醇正交試驗(yàn)考察點(diǎn)。

從表4可以看出，輕組分中含有的1，8-桉葉素含量明顯高于重組分，松油烯-4-醇在重組分中含量相對(duì)較高，輕組分1，8-桉葉素相對(duì)含量隨進(jìn)料速率增加呈現(xiàn)先降后增的趨勢(shì)，且在2.5 mL/min時(shí)達(dá)到最大3.82%；松油烯-4-醇相對(duì)含量在重組分中隨進(jìn)料速率增加呈現(xiàn)先降后增的走勢(shì)，含量相差不大，且在2.5mL/min時(shí)達(dá)到了最大55.65%。結(jié)合圖3，2.5 mL/min時(shí)分離得到的兩者都較多。因此，選擇2.5 mL/min為松油烯-4-醇正交試驗(yàn)考察點(diǎn)。

從表5可以看出，輕組分中含有的1，8-桉葉素含量明顯高于重組分，松油烯-4-醇在重組分中含量相對(duì)較高，輕組分1，8-桉葉素相對(duì)含量隨刮膜轉(zhuǎn)速增加呈現(xiàn)先降后增的趨勢(shì)，且在450 r/min時(shí)達(dá)到最大3.85%；松油烯-4-醇相對(duì)含量在重組分中隨刮膜轉(zhuǎn)速增加呈現(xiàn)先增后降的走勢(shì)，且在450 r/min時(shí)達(dá)到了最大56.54%，再結(jié)合圖4，可知，在450 r/min時(shí)1，8-桉葉素、松油烯-4-醇兩者含量相對(duì)較高。所以，選擇450 r/min為正交試驗(yàn)考察點(diǎn)。

表5 不同刮膜轉(zhuǎn)速下各組分特征成分含量Table 5 Characteristic composition of each component at different scratch film speed

2.5 正交試驗(yàn)因素水平及相關(guān)結(jié)果

按照“1.3.2.6”的內(nèi)容，結(jié)合如下正交試驗(yàn)因素水平（表6），以輕組分中1，8-桉葉素及重組分中松油烯-4-醇相對(duì)含量為考察指標(biāo)，得到如下正交試驗(yàn)及相關(guān)結(jié)果，見表7～表10。

表6 正交試驗(yàn)因素水平Table 6 Factors and levels of orthogonal experiment

表7 1，8-桉葉素正交試驗(yàn)及相關(guān)結(jié)果Table 7 Orthogonal experiment and related results of 1，8-cineole

由表7可知，正交因素對(duì)輕組分中1，8-桉葉素的影響順序?yàn)椋篋＞B＞C＞A，即刮膜轉(zhuǎn)速對(duì)輕組分中1，8-桉葉素富集影響最大，其次為蒸餾壓力和進(jìn)料速率，蒸餾溫度對(duì)1，8-桉葉素的富集影響相對(duì)較小。條件以A1B2C2D2為最佳，即蒸餾溫度38℃，蒸餾壓力110 Pa，進(jìn)料速率2.5 mL/min，刮膜轉(zhuǎn)速450 r/min。由表8可知，蒸餾壓力、進(jìn)料速率及刮膜轉(zhuǎn)速對(duì)輕組分中1，8-桉葉素含量影響較為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蒸餾溫度對(duì)1，8-桉葉素影響差異不明顯。

表8 1，8-桉葉素方差分析Table 8 Variance analysis of 1，8-cineole

表9 松油烯-4-醇正交試驗(yàn)及相關(guān)結(jié)果Table 9 Orthogonal experiment and related results of Terpinen-4-ol

表10 松油烯-4-醇方差分析Table 10 Variance analysis of Terpinen-4-ol

由表9可知，正交因素對(duì)重組分中松油烯-4-醇的影響順序?yàn)椋篈＞B＞D＞C，即蒸餾溫度對(duì)重組分中松油烯-4-醇富集影響最大，其次為蒸餾壓力和刮膜轉(zhuǎn)速，進(jìn)料速率對(duì)松油烯-4-醇的富集影響相對(duì)較小。條件以A1B2C3D2為最佳，即蒸餾溫度38℃，蒸餾壓力110 Pa，進(jìn)料速率3 mL/min，刮膜轉(zhuǎn)速450 r/min。由表10可知，蒸餾溫度對(duì)重組分中松油烯-4-醇含量影響極為顯著，蒸餾壓力對(duì)重組分中松油烯-4-醇含量影響較為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)料速率及刮膜轉(zhuǎn)速對(duì)松油烯-4-醇影響不明顯。

2.6 正交試驗(yàn)的工藝驗(yàn)證

取上述試驗(yàn)相同的茶樹油20 mL，共3份，按蒸餾溫度38℃，蒸餾壓力110 Pa，進(jìn)料速率2.5 mL/min，刮膜轉(zhuǎn)速450 r/min的工藝條件進(jìn)行分離，計(jì)算輕組分中1，8-桉葉素的相對(duì)含量。同理在蒸餾溫度38℃，蒸餾壓力110 Pa，進(jìn)料速率3 mL/min，刮膜轉(zhuǎn)速450 r/min的工藝條件下計(jì)算重組分中松油烯-4-的相對(duì)含量，結(jié)果見表11。

表11 提取工藝驗(yàn)證表Table 11 Extraction process validation

由表11可以發(fā)現(xiàn)：在最優(yōu)條件下，1，8-桉葉素的相對(duì)含量平均值達(dá)到5.33%，RSD值1.42%；松油烯-4-醇相對(duì)含量達(dá)到65.17%，RSD值為1.85%。

3 結(jié)論和討論

本研究通過單因素試驗(yàn)分析了蒸餾溫度、蒸餾壓力、進(jìn)料速率和刮膜轉(zhuǎn)速4個(gè)因素對(duì)茶樹油中1，8-桉葉素和松油烯-4-醇分離效果的影響，依據(jù)所確定的因素，設(shè)計(jì)了四因素三水平的正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化了分離工藝，為深入開發(fā)利用茶樹油提供理論基礎(chǔ)。1，8-桉葉素和松油烯-4-醇是茶樹油的特征組分，但由于1，8-桉葉素在茶樹油中含量較低，傳統(tǒng)的分離技術(shù)很難達(dá)到預(yù)期的效果，導(dǎo)致利用率相對(duì)較低。運(yùn)用刮膜式分子蒸餾技術(shù)在合理的條件下能夠?qū)?，8-桉葉素和松油烯-4-醇進(jìn)行富集，從而研究各自的藥理活性。

本研究所用的茶樹油經(jīng)氣相質(zhì)譜檢測(cè)其1，8-桉

（）（）葉素的相對(duì)含量為2.764%，松油烯-4-醇為43.416%，通過分子蒸餾技術(shù)將1，8-桉葉素相對(duì)含量提升至5.33%，松油烯-4-醇的含量提升至65.17%，富集效果明顯，但仍不能滿足應(yīng)用需求，這或許和單因素試驗(yàn)中因素?cái)?shù)值設(shè)立的不夠合理有關(guān)，通過多級(jí)分子蒸餾能夠進(jìn)一步的提升富集程度，從而達(dá)到應(yīng)用要求，但還需不斷摸索。