李曰進 劉華民 紀 龍 徐希柱 劉雪貞 馮 霞 王友信 李 棟 王 嵬

(山東第一醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，泰安271016)

類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、進行性、自身免疫性疾病，以累及周身關節(jié)的滑膜炎導致關節(jié)腫痛為主要表現(xiàn)[1]。其病程較長，致殘率高，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。RA在世界范圍內(nèi)的患病率已達2%，中國人群患病率已達1%，且女性較多見[3,4]。RA的發(fā)病機制目前尚未清楚，病因復雜，與遺傳易感性、環(huán)境因素、免疫異常、飲食習慣以及心理社會因素等有關[5-7]。

已有研究顯示，RA 與IgG糖鏈結(jié)構(gòu)異常有關，IgG Fc段連接的糖基結(jié)構(gòu)的微小變化可以影響Fc段的構(gòu)型，從而改變甚至逆轉(zhuǎn)IgG的分子功能[8]。如糖基末端增加唾液酸和半乳糖，IgG與Fc受體結(jié)合能力減弱，導致自身抗體性炎癥反應減弱，調(diào)控IgG抗體的促炎功能轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡坠δ?IgGN-糖基缺少核心巖藻糖修飾，抗體依賴的細胞介導的毒作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)增強，導致自身免疫性疾病發(fā)生[9,10]。目前研究已經(jīng)證實，異常IgGN-糖基化水平與多種炎癥性和自身免疫性疾病存在關聯(lián)，可以作為疾病診斷或預后的分子生物標志物[11-14]。本研究擬通過分析類風濕性關節(jié)炎和正常人群組間血漿 IgGN-糖基水平差異，利用ROC曲線探討類風濕性關節(jié)炎的潛在糖基生物標志物，為闡明類風濕性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展機制提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2014年中國唐山市冀東油田醫(yī)院體檢人群，納入研究。排除標準：①患有心血管、呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液和癌癥等任何嚴重疾病的患者；②無個人信息和血液樣本。類風濕性關節(jié)炎診斷標準：①晨僵至少持續(xù)1 h；②有3個或3個以上的關節(jié)同時腫脹或有積液；③掌指關節(jié)、近端指間關節(jié)或腕關節(jié)中至少有1個關節(jié)腫脹或有積液；④在二項所列舉的關節(jié)中，同時出現(xiàn)對稱性腫脹或積液的關節(jié)；⑤皮下類風濕結(jié)節(jié)；⑥類風濕因子陽性；⑦手和腕的后前位X線照片顯示有骨侵蝕或有明確的骨質(zhì)疏松。以上 1～4條必須持續(xù)出現(xiàn)至少6周或12周；具備4條或4條以上者，可診斷為類風濕性關節(jié)炎。

共計納入318例研究對象，年齡10～73歲，平均為(47.12±8.43)歲，其中男性42例(13.21%)，女性276例(86.79%)。RA組123例(38.68%)，對照組195例(61.32%)；RA組平均年齡為(50.69±11.53)歲，對照組平均年齡為(44.86±4.40)歲；RA組男性18例(14.63%)，女性105例(85.37%)。

1.2方法

1.2.1樣本采集及處理方法 使用乙二胺四乙酸二鈉(Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)真空采血管采集研究對象晨起空腹肘部外周靜脈血液樣本5 ml用于N-糖基組學分析，立即置于冰盒中保存運送。血液樣本在低溫離心機內(nèi)4℃ 3 000 r/min離心10 min，用移液器吸取上層血漿樣本，分裝于3個1.5 ml離心管，置于-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2糖基檢測方法 采用親水交互高效液相色譜-超高效液相色譜法(Hydrophilic interaction high performance liquid chromatography-ultra performance liquid chromatography，HILIC-UPLC)對血漿IgGN-糖基進行定量檢測，該方法是一種基于96孔G蛋白單片板的高通量、自動分析技術(shù)。該方法的簡要流程為：①制備96孔板Protein G提取；②IgG分離；③IgG去糖基化；④糖鏈標記及純化；⑤液相色譜與電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(LC-ESI-MS)檢測分析。最終得到24個不同的色譜峰,由于GP3相對峰下面積最小，故將GP3排除分析。在直接測得的24個色譜峰基礎上，根據(jù)文獻報道，計算糖基衍生結(jié)構(gòu)[15]。

2 結(jié)果

2.1IgGN-糖基直接測量指標組間差異比較 如表1所示，在類風濕性關節(jié)炎組和對照組中，GP4、GP8和GP14糖基峰的含量為最多，約占各組總糖基峰的50%。GP1、GP2、GP4-GP6、GP11、GP19、GP22和GP24均為RA組高于對照組(P均<0.05)；GP9、GP12-GP18和GP20為RA組低于對照組(P均<0.05)，差異均具有統(tǒng)計學意義。

2.2血漿IgGN-糖基與類風濕性關節(jié)炎相關性 校正年齡和性別因素后，GP1、GP2、GP4-GP6、GP11、GP19和GP24均與RA疾病呈正相關(P均<0.05)；GP9、GP12-GP15、GP17、GP18和GP20均與RA疾病呈負相關(P均<0.05)；G0n(無半乳糖基化)和Gal-ratio(無半乳糖基化的糖基結(jié)構(gòu)所占比例)為RA疾病的危險因素，OR值分別為5.75(95%CI 3.71～8.92)和8.53(95%CI 4.86～14.95)；G1n(單半乳糖基化)和G2n(雙半乳糖基化)為RA疾病的保護因素，OR值分別為0.59(95%CI 0.45～0.77)和0.19(95%CI 0.12～0.29)；FtotalS1/FtotalS2和FS1/FS2均為RA疾病的保護因素，OR值分別為0.18(95%CI 0.11～0.29)和0.33(95%CI 0.23～0.47)(表2)。

表1 類風濕關節(jié)炎組和對照組IgGN-糖基水平差異比較

Tab.1 Comparison of IgGN-glycosylation levels between rheumatoid arthritis group and control group

IgG N-glycansStructureRheumatoid arthritis(n=123)x±sM(QR)Control(n=195)x±sM(QR)P valueGP10.16±0.090.14(0.11)0.07±0.030.06(0.04)<0.0011)GP20.82±0.470.70(0.68)0.50±0.250.43(0.30)<0.0011)GP423.69±7.4522.92(9.81)16.04±4.1515.51(5.22)<0.0011)GP50.20±0.070.18(0.06)0.15±0.060.13(0.04)<0.0011)GP65.14±1.205.09(1.68)4.05±0.983.93(1.22)<0.0011)GP70.51±0.220.44(0.25)0.47±0.200.45(0.23)0.2821)GP818.95±1.8218.98(2.35)18.89±1.6618.92(2.19)0.7542)GP98.94±1.408.73(2.07)9.26±1.299.23(1.69)0.0342)GP104.65±0.834.65(1.29)4.65±0.904.51(1.01)0.5841)GP110.58±0.130.56(0.15)0.51±0.110.49(0.14)<0.0011)GP121.08±0.610.91(0.78)1.51±0.691.43(0.91)<0.0011)GP130.28±0.070.28(0.08)0.31±0.720.30(0.08)<0.0011)GP1414.06±4.1513.98(5.64)19.79±3.3420.12(4.70)<0.0011)GP151.81±0.411.80(0.54)2.07±0.382.08(0.55)<0.0012)GP162.72±0.492.67(0.54)2.80±0.482.81(0.63)0.1642)GP171.01±0.270.96(0.35)1.11±0.331.06(0.42)0.0071)GP189.54±2.879.09(3.88)12.56±2.3912.60(4.06)<0.0012)GP191.69±0.481.60(0.48)1.36±0.231.35 (0.27)<0.0011)GP200.28±0.080.27(0.09)0.31±0.080.30 (0.10)0.0011)GP210.49±0.100.48(0.12)0.49±0.080.49 (0.08)0.3111)GP220.09±0.030.09(0.04)0.08±0.020.08 (0.02)0.0111)GP231.65±0.421.61(0.53)1.68±0.321.69 (0.40)0.1881)GP241.46±0.461.40(0.50)1.15±0.231.12 (0.31)<0.0011)

表2 血漿IgGN-糖基指標與類風濕性關節(jié)炎的相關性

Tab.2 Correlation between plasma IgGN-glycosylation index and rheumatoid arthritis

IgG N-glycanscOR value(95%CI)aOR value(95%CI)PGP118.57(9.28-37.13)17.52(8.72-35.22)<0.0011)GP22.69(1.99-3.64)2.31(1.68-3.190<0.0011)GP45.53(3.66-8.35)5.18(3.36-8.00)<0.0011)GP52.31(1.67-3.20)2.03(1.47-2.8)<0.0011)GP62.95(2.19-3.97)2.54(1.84-3.49)<0.0011)GP90.78(0.62-0.98)0.74(0.58-0.95)0.0181)GP111.88(1.45-2.44)1.60(1.22-2.10)0.0011)GP120.45(0.34-0.61)0.51(0.38-0.70)<0.0011)GP130.63(0.48-0.83)0.67(0.50-0.88)0.0041)GP140.16(0.11-0.24)0.16(0.10-0.24)<0.0011)GP150.48(0.37-0.63)0.55(0.42-0.73)<0.0011)GP170.70(0.51-0.90)0.76(0.58-0.99)0.0421)GP180.26(0.19-0.37)0.29(0.21-0.42)<0.0011)GP193.31(2.31-4.74)2.78(1.94-3.99)<0.0011)GP200.68(0.53-0.87)0.77(0.59-1.00)0.0461)GP221.38(1.09-1.73)1.25(0.98-1.60)0.068GP243.02(2.16-4.22)2.59(1.84-3.64)<0.0011)GalactosylationG0n5.99(3.97-9.05)5.75(3.71-8.92)<0.0011)G1n0.57(0.44-0.74)0.59(0.45-0.77)<0.0011)G2n0.18(0.12-0.27)0.19(0.12-0.29)<0.0011)Gal-ratio8.82(5.21-14.93)8.53(4.86-14.95)<0.0011)SialylationFtotalS1/FtotalS20.16(0.10-0.25)0.18(0.11-0.29)<0.0011)FS1/FS20.28(0.19-0.39)0.33(0.23-0.47)<0.0011)FucosylationFntotal1.15(0.92-1.46)1.16(0.91-1.48)0.24Fn0.86(0.68-1.07)0.94(0.74-1.20)0.63

Note：cOR represents the odds ratio after unadjusted age and gender；aOR represents the odds ratio after adjusting for age and gender；1)P<0.05,the difference was statistically significant.

圖1 IgG N-糖基診斷類風濕性關節(jié)炎的ROC曲線圖Fig.1 ROC curve of IgG N-glycosylation for diagnosis of rheumatoid arthritisNote: A.ROC plot for the diagnosis of RA with a single glycan-based indicator；B.A graph of the combined diagnosis of RA with a glycosylation index.

2.3血漿IgGN-糖基生物標志物篩選 與類風濕性關節(jié)炎相關的糖基指標經(jīng)逐步回歸篩選后，模型最終納入4個變量(GP1、GP2、GP4和GP24)。單個IgGN-糖基指標診斷RA的ROC曲線下面積分別為：GP1(AUC=0.880，95%CI 0.836～0.925)、GP2(AUC=0.759，95%CI 0.695～0.822)、GP4(AUC=0.840，95%CI 0.789～0.891)和GP24(AUC=0.772，95%CI 0.713～0.831)(圖1A)。糖基指標聯(lián)合ROC曲線下面積AUC=0.919(95%CI 0.883～0.954)(圖1B)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，調(diào)整年齡和性別因素后，有16個糖基直接指標與6個衍生指標在類風濕性關節(jié)炎組和對照組之間存在統(tǒng)計學差異。在16個糖基直接指標中，相比于對照組，高水平的GP1、GP2、GP4、GP6和GP24能增加類風濕性關節(jié)炎的患病風險，GP9、GP12、GP13、GP15、GP17、GP18和GP20是類風濕性關節(jié)炎的保護性因素。GP1、GP2、GP4和GP6是末端沒有半乳糖基化和唾液酸化修飾的糖基結(jié)構(gòu)，GP9、GP12、GP13及GP15是末端有半乳糖基化修飾的糖基結(jié)構(gòu)，GP17、GP18、GP20及GP24都是末端含有唾液酸化修飾的糖基結(jié)構(gòu)。因此，提示我們半乳糖基化及唾液酸化水平降低會增加類風濕性關節(jié)炎的患病風險。在6個衍生指標中，G0n(無半乳糖基化)和Gal-ratio(無半乳糖基化的糖基結(jié)構(gòu)所占比例)水平升高會增加RA患病風險，G1n(單半乳糖基化)和G2n(雙半乳糖基化)水平降低會增加RA患病風險；唾液酸化水平(FtotalS1/FtotalS2和FS1/FS2)降低會增加RA患病風險。 本次研究發(fā)現(xiàn)，GP1、GP4、GP6、GP11、GP19及GP24糖基峰均在類風濕性關節(jié)炎患者中水平升高，雖然以上糖基峰均含有核心巖藻糖基結(jié)構(gòu)，然而相比于對照組，其他含有核心巖藻糖基結(jié)構(gòu)的糖基峰(GP14、GP15、GP18和GP20)以及不含核心巖藻糖基結(jié)構(gòu)的糖基峰(GP12、GP13)在RA患者中水平較低，因此尚不能得出核心巖藻糖基化水平升高或降低會增加類風濕性關節(jié)炎的患病風險。

血漿IgGN-糖基的特定譜型可及時反映機體多種生理和病理改變，復雜的糖基標志物能更好地描述機體狀態(tài)。已有研究表明，IgGN-糖基指標較傳統(tǒng)生物標志物有更高的靈敏度和特異度，可以提供更加準確的疾病預測信息[14]。此次研究發(fā)現(xiàn)，單個糖基指標GP1對RA的診斷效力最大(AUC=0.880，95%CI 0.836～0.925)；而糖基指標聯(lián)合診斷效力可達0.923，因此我們認為血漿IgGN-糖基有望作為類風濕性關節(jié)炎的診斷分子標志物，有助于實現(xiàn)類風濕性關節(jié)炎疾病的早期預警，為進一步探索糖基組學與類風濕性關節(jié)炎的早期診斷提供理論基礎。