劉瑞婷，朱文瑛，張琳，唐躍，曹銘鋒，蔣進(jìn)皎

(山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院，濟(jì)南250021)

糖尿病神經(jīng)病變作為一種常見的糖尿病并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。早期糖尿病神經(jīng)病變的研究多集中于糖尿病周圍神經(jīng)病變，近期研究表明，糖尿病對中樞神經(jīng)系統(tǒng)同樣存在損傷。研究表明，糖尿病患者可出現(xiàn)記憶力、定向力等認(rèn)知功能下降，同時可出現(xiàn)人格改變、學(xué)習(xí)能力下降等[1～4]。目前，糖尿病中樞神經(jīng)病變的分子機(jī)制尚未充分闡明，阻礙了其治療的進(jìn)一步進(jìn)展。既往研究表明，糖尿病患者腦神經(jīng)元凋亡較無糖尿病病史患者明顯增多[5]；糖尿病小鼠模型神經(jīng)元凋亡較正常對照組增加[6]；高糖處理神經(jīng)元細(xì)胞可促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的發(fā)生[7]。研究結(jié)果證實(shí)，絲裂原活化蛋白激酶p38 (p38 MAPK)作為細(xì)胞凋亡調(diào)控密切相關(guān)的激酶，在高糖作用下其活性顯著增加[8]。因此認(rèn)為，高糖環(huán)境可能通過調(diào)節(jié)p38 MAPK活性以調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。2017年9月～2018年5月，本研究觀察高糖對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，并探討p38 MAPK在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 SH-SY5Y細(xì)胞，購于美國菌種保藏中心。抗磷酸化p38 MAPK及總p38 MAPK均購于美國Cell Signaling Technology公司，抗BAX、BID、BCL-2、BAD抗體均購于中國Proteintech公司，p38 MAPK抑制劑購于美國Sigma公司，Annexin V-PI染色試劑盒購于中國碧云天生物技術(shù)公司，ECL顯色液購于美國Millipore公司，胎牛血清購于美國Gibco公司，谷氨酰胺購于美國Sigma公司，青鏈霉素雙抗購于美國Sigma公司。蛋白電泳儀及電泳槽購于美國Bio-rad公司，顯影儀購于美國Thermo公司，熒光顯微鏡購于德國Zeiss公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 SH-SY5Y細(xì)胞采用含10%的胎牛血清、100 U/mL的青鏈霉素雙抗、2 mmol/L的谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、含5%二氧化碳的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，隨機(jī)進(jìn)行分組，A、B、C組分別加入45、90、135 mmol/L高糖處理1.5、3、6 h，D、E組分別加入10、25 μmol/L的p38 MAPK抑制劑PD169316預(yù)處理30 min，之后加入135 mmol/L高糖溶液培養(yǎng)12 h。對照組僅常規(guī)培養(yǎng)不做干預(yù)。另隨機(jī)選部分細(xì)胞用135 mmol/L高糖處理3 h作為高糖對照組。

1.3 細(xì)胞內(nèi)磷酸化p38 MAPK及凋亡相關(guān)蛋白檢測 采用Western blotting法。細(xì)胞處理后，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入含有PMSF及磷酸酶抑制劑的RIPA，冰上裂解30 min，離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后沸水煮10 min變性。根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，12%的SDS-聚丙烯凝膠電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗膜后二抗室溫孵育1 h，采用ECL法顯影。目的蛋白條帶密度與對應(yīng)內(nèi)參比較后，以相應(yīng)對照組的倍數(shù)作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 采用Annexin V-PI染色法。細(xì)胞處理后，根據(jù)試劑盒說明書采用Annexin V-FITC及PI染色，熒光顯微鏡細(xì)胞染色情況并拍照。綠色染色代表凋亡早期細(xì)胞，紅色染色代表凋亡中晚期及死亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 高糖對細(xì)胞內(nèi)磷酸化p38 MAPK及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 高糖處理1.5 h，與對照組比較，其他各組磷酸化p38 MAPK蛋白相對表達(dá)量高(P均<0.05)，而總p38 MAPK蛋白表達(dá)變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；各組BCL-2蛋白相對表達(dá)量低，其中C組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而BAX、BAD、BID蛋白相對表達(dá)量較對照組高，其中B、C組的BAX蛋白，C組的BAD蛋白，B組的BID蛋白相對表達(dá)量與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。高糖處理3 h，與對照組相比，各組磷酸化p38 MAPK蛋白相對表達(dá)量呈濃度依賴性升高(P均<0.05)，而總p38 MAPK蛋白表達(dá)變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與對照組相比，各組BCL-2蛋白相對表達(dá)量呈濃度依賴性降低，但僅C組與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組BAX、BAD、BID蛋白相對表達(dá)量均呈濃度依賴性升高，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。高糖處理6 h后，與對照組相比，各組磷酸化p38 MAPK蛋白相對表達(dá)量呈升高趨勢，其中A組升高更為明顯，而B、C組均較A組低(P均<0.05)?？俻38 MAPK在高糖處理后變化較對照組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。BCL-2蛋白相對表達(dá)量呈濃度依賴性降低，其中B、C組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與對照組相比，A、B組BAX蛋白相對達(dá)量高(P均<0.05)，A、B、C組BAD蛋白相對達(dá)量高(P均<0.05)，A組BID蛋白相對達(dá)量高(P<0.05)。見表1。

表1 高糖對細(xì)胞內(nèi)磷酸化p38 MAPK及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.2 p38 MAPK抑制劑對細(xì)胞內(nèi)磷酸化p38 MAPK及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與高糖對照組比較，D、E組磷酸化p38 MAPK蛋白相對表達(dá)量低(P均<0.05)，BCL-2蛋白相對表達(dá)量高(P均<0.05)，BAD蛋白及BID蛋白相對表達(dá)量低(P均<0.05)，E組以上指標(biāo)變化最明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 p38 MAPK抑制劑對細(xì)胞內(nèi)磷酸化p38 MAPK及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 p38 MAPK抑制劑對各組細(xì)胞凋亡的影響 根據(jù)染色結(jié)果與對照組比較，C組細(xì)胞凋亡重；與C組比較，E組細(xì)胞凋亡輕。

3 討論

作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，神經(jīng)元損害在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷中起重要作用。既往研究表明，高糖環(huán)境中培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞可能出現(xiàn)Aβ沉積、突觸數(shù)目減少，突觸功能異常等損害[9]；糖尿病動物模型的研究也證實(shí)長期高糖可能導(dǎo)致動物發(fā)生學(xué)習(xí)能力減低[10]；流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，糖尿病患者較非糖尿病患者語言學(xué)習(xí)能力降低[11]，2型糖尿病患者疾病晚期可出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變[12]，而早發(fā)的1型糖尿病患者可能出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的異常及認(rèn)知功能減低[2,13]。因此，研究高糖引起神經(jīng)元損害的機(jī)制對高糖引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有極其重要的意義。

p38 MAPK是真核細(xì)胞中高度保守的激酶，廣泛分布于全身各種器官及組織。作為壓力激活性激酶，p38 MAPK參與包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等等在內(nèi)的諸多調(diào)控過程[14]。在多種高血糖影響的細(xì)胞信號通路中，p38 MAPK與高糖刺激的關(guān)系非常密切，在高糖環(huán)境下p38 MAPK活性顯著增加，激活的p38 MAPK在肝臟糖脂代謝、骨骼肌及脂肪組織糖分?jǐn)z取、炎性因子產(chǎn)生以及凋亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用，與細(xì)胞的凋亡及死亡密切相關(guān)[15]，而且，應(yīng)用p38 MAPK抑制劑顯著改善了糖尿病引起的傷口愈合不良[16]。同時，p38 MAPK為在神經(jīng)細(xì)胞的功能和凋亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用[17]，p38 MAPK通路的抑制對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[18,19]。因此我們認(rèn)為，p38 AMPK通路抑制劑在減輕糖尿病相關(guān)的神經(jīng)元損傷中有一定價值。

神經(jīng)細(xì)胞的凋亡在神經(jīng)系統(tǒng)功能的損害中發(fā)揮重要作用[20]。目前已知的凋亡途徑共有3種：線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑以及死亡受體途徑，其中線粒體途徑是凋亡調(diào)控的主要途徑。線粒體凋亡途徑主要通過BCL家族調(diào)節(jié)，包括主要對凋亡起抑制作用的BCL-2亞家族(BCL-2)，對凋亡起促進(jìn)作用的BAX亞家族(BAX)以及BCL-2同源的結(jié)構(gòu)域3亞家族(BAD、BID)，當(dāng)細(xì)胞被某些外界或內(nèi)在信號影響，凋亡促進(jìn)蛋白及凋亡抑制蛋白之間的平衡穩(wěn)態(tài)被打破時，凋亡途徑將被激活，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡[21,22]。研究表明，BCL-2、BAX、BAD、BID作為重要的凋亡調(diào)控蛋白，在腦組織中發(fā)揮重要作用[23]。

本研究采用不同濃度的高糖處理SH-SY5Y細(xì)胞，結(jié)果顯示，高糖可顯著促進(jìn)p38 MAPK的磷酸化，同時增加促凋亡蛋白BAX、BAD、BID的表達(dá)，而凋亡抑制蛋白BCL-2的表達(dá)則降低，此作用在處理持續(xù)3 h時達(dá)到頂峰，其中C組p38 MAPK磷酸化程度及各凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)均較為明顯，因此后續(xù)p38 MAPK抑制劑相關(guān)試驗(yàn)我們選擇此處理濃度及時間點(diǎn)。加入p38 MAPK抑制劑可顯著減少高糖引起的細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白的表達(dá)?？梢姼咛菨舛鹊呐囵B(yǎng)基對SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用，該作用可能是通過增加p38MAPK的磷酸化并影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。該作用在處理3 h時達(dá)高峰。

綜上所述，本研究證實(shí)高糖可促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，而p38 MAPK抑制劑可抑制高糖導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，這為后續(xù)糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)藥物的研究提供了理論基礎(chǔ)。