付蓓蓓 鄭永強(qiáng) 徐 悅

［湖北省十堰市人民醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院），湖北 十堰 442000］

急性腦梗死是由于腦部血液供應(yīng)突然中斷后導(dǎo)致腦組織缺血缺氧引起腦組織神經(jīng)功能缺損的綜合征。本病在中老年人群高發(fā)，是致死和致殘的最主要原因，已排在我國(guó)死亡原因的第2位，致殘?jiān)虻牡?位。每年腦梗死治療費(fèi)用占到醫(yī)療健康預(yù)算的3%～7%［1-2］。隨著人口老齡化進(jìn)程的加速，其病死率、致殘率和醫(yī)療花費(fèi)都在增加。筆者在醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的臨床工作中體會(huì)到，急性腦梗死的治療主要是改善患者的活動(dòng)能力和生活質(zhì)量。因此，改善神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能是急性腦梗死的治療關(guān)鍵。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保肝等多種藥用價(jià)值［3］。黃芪甲苷是黃芪的主要有效成分，通過(guò)抑制缺血區(qū)苯二氮 受體的表達(dá)，減少半暗區(qū)面積，從而發(fā)揮保護(hù)腦組織的作用［4］。在發(fā)生急性腦梗死時(shí)，繼發(fā)性顱內(nèi)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是導(dǎo)致病情加重的一個(gè)重要因素［5］。 核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中重要的通路，可調(diào)控下游的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［6］。因此，本研究通過(guò)制備大鼠急性腦梗死模型，給予不同劑量的黃芪甲苷進(jìn)行干預(yù)，探討黃芪甲苷改善大鼠急性腦梗死神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能及其作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性8周齡SD大鼠40只［由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（魯）2012-0002，動(dòng)物合格證編號(hào)0001507］，體質(zhì)量200～240 g，動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度22～24℃，相對(duì)濕度為40%～70%，噪音≤50 dB的SPF環(huán)境中，自由進(jìn)食和飲水，控制飼養(yǎng)環(huán)境晝夜循環(huán)（12h/12h）。動(dòng)物相關(guān)處置均符合《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 黃芪甲苷（純度98%，國(guó)藥準(zhǔn)字Z51020664，產(chǎn)品批號(hào)0781200008，購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）；3%戊巴比妥 （購(gòu)于上海上藥新亞藥業(yè)有限公司）；羥甲基纖維素鈉（購(gòu)于湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司）；三苯基四氮唑（TTC）（購(gòu)于美國(guó)Biosharp公司）；鼠抗 NF-κB p65 和 IΚB 激酶 β（IKKβ）抗體（購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；鼠抗GADPH單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗鼠IgG二抗 （購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；蛋白抽提試劑盒（購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司）；ELISA試劑盒 （購(gòu)于欣博盛生物科技有限公司）。因黃芪甲苷難溶于水，用0.5%羥甲基纖維素鈉溶液溶解，配制成質(zhì)量濃度為80 mg/kg的黃芪甲苷應(yīng)用液備用。

1.3 分組及造模 對(duì)SD大鼠進(jìn)行編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠均分為4組：假手術(shù)組、模型組、溶劑對(duì)照組和黃芪甲苷組。大鼠禁食12 h后用3%戊巴比妥（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，對(duì)頸部進(jìn)行剃毛和消毒，使大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，沿頸正中線行手術(shù)切口，進(jìn)行肌肉鈍性分離，充分暴露右側(cè)血管，分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在距頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈分叉處約4 mm剪開(kāi)一個(gè)小口，將預(yù)先浸在肝素溶液中的尼龍魚(yú)線從開(kāi)口插入頸內(nèi)動(dòng)脈20 mm，阻塞大腦血流［7］。用生理鹽水清洗切口后逐層縫合。假手術(shù)組只切開(kāi)皮膚和分離血管，不阻塞血流。術(shù)后給予20萬(wàn)U青霉素肌肉注射，連續(xù)使用3 d。黃芪甲苷組腹腔注射給予80 mg/kg的黃芪甲苷應(yīng)用液，從術(shù)后第1日開(kāi)始，持續(xù)給予14 d。假手術(shù)組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉注射液，溶劑對(duì)照組給予等體積0.5%羥甲基纖維素鈉溶液。在第14日對(duì)大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分后處死大鼠，分離腦組織進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）TTC染色測(cè)定大鼠腦梗死體積。處死大鼠后取完整腦組織，每組3個(gè)腦組織置于冰箱中冷凍15 min，行冠狀位切片，厚度2 mm，置于2%的TTC染液中孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液終止染色。用4%的甲醛固定2 h后拍照，用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算梗死體積。2）神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。根據(jù)Bederson JB評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分，采用雙盲法，于造模后1 d和14 d各評(píng)1次。3）ELISA法檢測(cè)梗死側(cè)大腦皮層中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量。取適量右側(cè)腦組織，制成勻漿，吸取上清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行IL-1β和TNF-α含量測(cè)定，在450 nm處測(cè)各孔吸光度（A）值。4）Western blotting法檢測(cè)梗死側(cè)大腦皮層組織中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平。取適量右側(cè)腦組織，約50 mg，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，按1∶9加入蛋白抽提試劑，用超聲進(jìn)行破碎，裂解15 min后離心后取上清，進(jìn)行蛋白含量測(cè)定后調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度至10 mg/mL，加入1/5體積的5×Buffer進(jìn)行變性，-80℃保存。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行電泳、切膠；孵育一抗、孵育二抗，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用IBM SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行判斷，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各種大鼠腦梗死體積比較 見(jiàn)表1，圖1。假手術(shù)組未見(jiàn)梗死灶，其余各組均出現(xiàn)不同程度梗死。溶劑對(duì)照組與模型組比較，梗死體積無(wú)明顯減小，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組和溶劑對(duì)照組比較，黃芪甲苷組梗死體積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠腦梗死體積比較（%，±s）

表1 各組大鼠腦梗死體積比較（%，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與溶劑對(duì)照組比較，▲P＜0.05。 下同

組 別 n 大鼠腦梗死體積假手術(shù)組 3模型組 3溶劑對(duì)照組 3 0 25.13±5.06△24.90±4.93*黃芪甲苷組 313.85±3.64*▲

圖1 各種大鼠腦梗死體積比較

2.2 各組大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較 見(jiàn)表2。造模后直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，假手術(shù)組未見(jiàn)大鼠死亡，模型組、溶劑對(duì)照組和黃芪甲苷組大鼠分別死亡2只、3只和1只。造模后1 d，各組大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分無(wú)顯著差異（P＞0.05）；14 d后，溶劑對(duì)照組與模型組比較，大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與模型組和溶劑對(duì)照組比較，黃芪甲苷組大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較（分，±s）

表2 各組大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較（分，±s）

組 別 n 1 d 14 d假手術(shù)組 10模型組 8溶劑對(duì)照組 7 0 0 2.93±0.36△ 2.26±0.29△2.90±0.42 2.35±0.36*黃芪甲苷組 92.85±0.44 1.48±0.20*▲

2.3 各組大鼠梗死側(cè)大腦皮層中IL-1β和TNF-α含量比較 見(jiàn)表3。與假手術(shù)組比較，各組梗死側(cè)大腦皮層中IL-1β和TNF-α含量均增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，溶劑對(duì)照組梗死側(cè)大腦皮層中IL-1β和TNF-α含量降低不顯著，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組和溶劑對(duì)照組比較，黃芪甲苷組梗死側(cè)大腦皮層中IL-1β和TNF-α含量降低顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠梗死側(cè)大腦皮層中IL-1β和TNF-α含量比較（ng/L，±s）

表3 各組大鼠梗死側(cè)大腦皮層中IL-1β和TNF-α含量比較（ng/L，±s）

組 別 n IL-1β TNF-α假手術(shù)組 7模型組 5溶劑對(duì)照組 4 23.94±5.57 146.82±12.37 75.79±10.30△ 394.52±46.62△71.03±8.82△ 373.40±47.49△黃芪甲苷組 632.74±4.16*△▲ 213.73±33.06*△▲

2.4 各組大鼠梗死側(cè)大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平比較 見(jiàn)表4，圖2。與假手術(shù)組比較，各組梗死側(cè)大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平均增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組和溶劑對(duì)照組比較，溶劑對(duì)照組梗死側(cè)大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平降低不顯著，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組和溶劑對(duì)照組比較，黃芪甲苷組梗死側(cè)大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平降低顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 各組大鼠梗死側(cè)大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平比較（±s）

表4 各組大鼠梗死側(cè)大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白水平比較（±s）

組 別 n NF-κB p65 IKKβ假手術(shù)組 7模型組 5溶劑對(duì)照組 4 0.16±0.02 0.12±0.03 0.74±0.09△ 0.61±0.08△0.79±0.12△ 0.64±0.07△黃芪甲苷組 60.37±0.06*△▲ 0.29±0.05*△▲

圖2 各組大鼠梗死側(cè)大腦皮層中NF-κB p65和IKKβ蛋白表達(dá)

3 討 論

目前，對(duì)急性腦梗死的治療原則是恢復(fù)梗死區(qū)腦組織的血液灌流，保護(hù)依然存活的腦組織，減輕繼發(fā)性的腦損傷。組織型凝血酶原激活物（tPA）是唯一通過(guò)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）許可的治療急性腦梗死的藥物，但因其治療時(shí)間窗只有3 h，影響了臨床使用率［8］。溶栓后對(duì)腦組織的保護(hù)是急性腦梗死治療的核心，在腦缺血和再灌注后結(jié)構(gòu)及功能破壞是引起腦梗死并發(fā)癥的重要原因。同時(shí)，抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)能顯著降低其并發(fā)癥［9］。糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物是腦梗死后期腦保護(hù)治療的一線藥物，但其增加感染風(fēng)險(xiǎn)、消化系統(tǒng)潰瘍等副作用限制了其臨床應(yīng)用［10］。同時(shí)，諸如心房肽、鈣調(diào)蛋白拮抗劑等目前開(kāi)發(fā)的新藥尚未進(jìn)入臨床［11-12］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載，黃芪有利水消腫、益氣理虛、扶正固本等功效。黃芪甲苷是衡量黃芪有效成分含量的一個(gè)重要的單體指標(biāo)，其具有良好的有抗炎、抗氧化功能［13］。本研究結(jié)果顯示，給予黃芪甲苷后，大鼠腦梗死體積顯著減小、神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著下降，提示黃芪甲苷能減小急性腦梗死大鼠的梗死體積和改善神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能。

炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)是炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)，最終由炎癥介質(zhì)發(fā)揮作用。IL-1β是體內(nèi)作用最強(qiáng)的炎癥因子，是TNF-α級(jí)聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物，TNF-α是炎癥后最早出現(xiàn)的細(xì)胞因子，當(dāng)他們過(guò)度表達(dá)時(shí)介導(dǎo)炎癥因子趨化作用而加劇瀑布樣炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織損傷［14-15］。NF-κB通路參與了急性缺血性損傷的病理生理過(guò)程。其家族包含 RelA （p65）、NF-κBI、RelB、NF-κB2 和 c-Rel 5個(gè)成員，通過(guò)經(jīng)典和非經(jīng)典兩種途徑來(lái)發(fā)揮炎癥反應(yīng)調(diào)控作用［16］。其中經(jīng)典途徑主要與炎癥反應(yīng)有關(guān)，依賴(lài)于 IKKβ 水平的變化［17］。 靜息狀態(tài)下，NF-κB 處于低表達(dá)水平，與NF-κB的抑制因子（I-κB）結(jié)合形成非活性的二聚體。當(dāng)發(fā)生缺血損傷時(shí)，在炎癥介質(zhì) （如ICAM-1、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2 等）的刺激下，通過(guò)細(xì)胞膜上的Toll樣受體4（TLR-4）特異性識(shí)別炎癥信號(hào)，使IKKβ表達(dá)水平增加，磷酸化I-κB并將其水解，識(shí)別 NF-κB p65，使 NF-κB p65 得到釋放，從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)［18-19］。研究顯示，香芹酚能通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)（TNF-α和IL-1β）的表達(dá)來(lái)調(diào)控NF-κB p65和IKKβ的表達(dá)水平來(lái)發(fā)揮保護(hù)大鼠急性腦梗死后神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能［20］。本研究結(jié)果與之相符。

綜上所述，黃芪甲苷能改善急性腦梗死大鼠的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能，在腦梗死早期給予黃芪甲苷，能顯著降低炎癥因子（IL-1β和TNF-α等）的表達(dá)水平，從而抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)達(dá)到改善腦梗死預(yù)后的目的。本研究對(duì)黃芪甲苷治療腦梗死患者預(yù)后提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，黃芪甲苷藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)需進(jìn)一步研究。