吳 迪 劉 彤 楊 鶯△

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

急性心肌梗死（AMI）是一類非常嚴(yán)重的缺血性心臟病，主要指由冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧引起的心肌壞死。AMI有起病急，致死致殘率高等特點(diǎn)，已成為威脅人類健康的重要原因［1］。目前，缺血性心臟病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，缺血性心血管病占我國(guó)心血管病總發(fā)病數(shù)的65%［2］。而心梗后心肌在得到再灌注的同時(shí)也伴隨著一系列的心臟和血管的不良事件，如心律失常、心肌收縮功能障礙、甚至無復(fù)流等影響心肌缺血預(yù)后的事件［3］。心肌梗死在中醫(yī)學(xué)屬“胸痹”“心痛”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心肌梗死病機(jī)屬本虛標(biāo)實(shí)，本虛以氣陰虧虛為主，不榮則痛；標(biāo)實(shí)則是血瘀痰飲痹阻脈絡(luò)，不通則痛。而雙參通脈顆粒在養(yǎng)陰通脈治法的指導(dǎo)下對(duì)急性心肌梗死起到治療作用。研究表明，炎癥反應(yīng)是造成心肌缺血再灌注損傷的重要原因之一［4-5］。血管細(xì)胞黏附分子 （VCAM-1）是組織炎性反應(yīng)的主要因子，在炎癥發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，與心腦血管疾病有密切關(guān)系［6］。 腫瘤壞死因子-α（TNF-α）與心肌缺血再灌注損傷具有密切相關(guān)性［7］，TNF-α主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，并與多種心臟疾病，如心力衰竭、缺血性心肌病等有關(guān)的一種炎性因子，而炎癥反應(yīng)可進(jìn)一步加重心肌缺血損傷，也是心肌缺血再灌的主要病理機(jī)制之一［8］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察心肌組織中 VCAM-1、TNF-α的表達(dá)情況及光鏡（HE染色）下觀察心肌組織的病理改變來間接判斷基于養(yǎng)陰通脈法指導(dǎo)下的雙參通脈顆粒對(duì)心肌缺血再灌注損傷心肌的治療效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠，10～12周齡，雄性，體質(zhì)量 250～280 g，共 40只，動(dòng)物許可證號(hào) SYXK（遼）2016-0063，自由飲水，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試藥與儀器 1）藥物：雙參通脈顆粒（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，批號(hào)20160531），由人參、丹參、黃芪、麥冬、川芎、當(dāng)歸6味藥組成；西藥合心爽（天津田邊制藥有限公司，批號(hào)1411087）；麻醉藥水合氯醛（上海化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20130413，20131127）現(xiàn)用現(xiàn)配；2）試劑：VCAM-1、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）檢測(cè)試劑盒（美國(guó)凱基生物有限公司，批號(hào)分別為 141425、141306）。3）儀器：DMS300Leica 圖像分析儀 （德國(guó)Leica公司）；HL-B6型小動(dòng)物呼吸機(jī)（北京新利科技有限公司）；CA52-3型全自動(dòng)生化分析儀（長(zhǎng)沙湘江儀器公司）；5234R型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppdendorf公司）；OM3123型冰凍切片機(jī)（瑞典Bio公司）；恒溫恒濕箱（上?？萍忌锕荆?/p>

1.3 分組和造模［9］健康SD大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、中藥組、西藥組，每組10只。對(duì)模型組、中藥組、西藥組動(dòng)物進(jìn)行造模，復(fù)制急性心肌缺血再灌注模型。取大鼠稱質(zhì)量，采用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g，腹腔麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，記錄結(jié)扎前5 minⅡ?qū)?lián)心電圖，然后剪毛、消毒、鋪巾，無菌下常規(guī)切開胸骨、心包、暴露出心臟，并于左冠狀動(dòng)脈前降支起始下2 mm處結(jié)扎，可見左心室前壁光澤度降低，并變蒼白無血色，大鼠心臟搏動(dòng)減弱，記錄結(jié)扎后5 min、30 min和2 h的心電圖，采用多導(dǎo)生理記錄儀監(jiān)測(cè)顯示心電圖標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)，ST段抬高和（或）T波抬高（圖1：造模前后Ⅱ?qū)?lián)心電圖變化）。將以上標(biāo)志作為急性心肌梗死建模成功的標(biāo)志。結(jié)扎持續(xù)30 min后，打開結(jié)扎線。不結(jié)扎正常對(duì)照組，檢查無出血后，將胸腔逐層關(guān)閉。

圖1 造模前后Ⅱ?qū)?lián)心電圖變化

1.4 干預(yù)方法 空白對(duì)照組與模型組，用生理鹽水3 mL/kg進(jìn)行連續(xù)灌胃2周，每日1次。中藥組予雙參通脈顆粒劑，用生理鹽水制成3 mL/kg的混合液，相當(dāng)于生藥量11 g/kg。西藥組予合心爽用生理鹽水制成3 mL/kg混合液，質(zhì)量濃度4.23 mg/kg。各組連續(xù)灌胃2周，每日1次。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）心肌組織病理檢測(cè)。2周后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后，打開胸腔，摘取心臟，置于無菌的生理鹽水中，立即取下1 mm3的缺血心肌組織數(shù)塊，分別置于10%的甲醛液中固定進(jìn)行TUNEL，-80℃冰箱中冷藏用作光鏡下病理檢測(cè)。2）血清中VCAM-1檢測(cè)。造模成功后，開腹并暴露腹主動(dòng)脈，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血5mL，低溫離心后取上層血清，試管編號(hào)，相關(guān)步驟嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫試劑盒要求進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算出各樣本血清濃度。3）血清TNF-α含量檢測(cè)。經(jīng)腹主動(dòng)脈負(fù)壓采血5 mL左右，低溫離心取上層血清，試管編號(hào)后，ELISA法檢測(cè)血清TNF-α含量，按試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定：將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當(dāng)濃度，5%小牛血清置37℃封閉40 min，洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍30 min，將稀釋好的樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中，每樣品至少加雙孔，37 ℃，40～60 min，加入酶標(biāo)抗體，37 ℃，30～60 min，加入底物液，37℃避光放置3～5 min，加入終止液顯色，25 min內(nèi)測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS for Windows軟件包進(jìn)行方差分析、q檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，計(jì)量資料以（±s）表示。組間比較均采用多重比較SNK-q方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下大鼠心肌組織病理改變 見圖2。心肌組織切片HE染色，可見空白對(duì)照組心肌組織無明顯變性、壞死，心肌纖維排列較規(guī)則，染色均勻，橫紋清晰，組織間隙水腫較輕，僅有輕度淤血等改變；模型組有部分心肌局灶性壞死，心肌纖維斷裂，染色疏松，細(xì)胞及組織間隙水腫明顯，心肌間質(zhì)有出血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；中藥組及西藥組示心肌纖維較模型組排列規(guī)整、斷裂較少，組織間隙水腫較輕，心肌間質(zhì)輕度出血。

圖2 各組心肌細(xì)胞病理改變（HE染色，200倍）

圖3 各組心肌細(xì)胞VCAM-1表達(dá)

2.2 各組大鼠血清VCAM-1心肌組織中的表達(dá)比較見圖3，表1。對(duì)照組中VCAM-1在心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞呈微弱的陽(yáng)性表達(dá)，中藥組和西藥組中，有少量VCAM-1在心肌細(xì)胞間質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，模型組可見VCAM-1在心肌細(xì)胞間質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，且強(qiáng)度增強(qiáng)和范圍擴(kuò)大。

表1 各組大鼠血清VCAM-1含量比較（±s）

表1 各組大鼠血清VCAM-1含量比較（±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與中藥組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n 面積 灰度對(duì)照組 10 7209.50±1611.79 2773.30±695.35模型組 10 45081.60±4222.11*△ 19762.39±11840.51*中藥組 10 15251.10±1814.35*# 6412.99±1814.35*#西藥組 10 21686.00±1965.96*#△ 8992.41±623.12*#△

2.3 各組大鼠血清TNF-α心肌組織中的表達(dá)比較見表2。結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組相比TNF-α的表達(dá)程度明顯升高，中藥組和西藥組中TNF-α的表達(dá)程度較低。

表2 各組大鼠血清TNF-α含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清TNF-α含量比較（±s）

組 別 n 面積 灰度對(duì)照組 10 7698.40±1023.52 3185.48±372.71模型組 10 52617.90±13586.60* 21674.45±3974.23*中藥組 10 13829.60±3252.91*# 5687.64±1002.32*#西藥組 10 19574.50±4719.00*#△ 8607.63±2563.20*#△

3 討 論

本研究采用大鼠急性心肌梗死模型，通過比較大鼠心肌組織病理變化及各組間心肌組織 VCAM-1及TNF-α的表達(dá)情況，分析了基于益氣養(yǎng)陰法指導(dǎo)下的雙參通脈顆粒對(duì)心肌缺血再灌注后大鼠心肌組織的氧化損傷的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示西藥組和中藥組VCAM-1和TNF-α的表達(dá)與模型組相比有明顯下降（P＜0.05）。說明雙參通脈顆粒對(duì)心肌缺血再灌注后的心肌組織具有一定的保護(hù)作用。且現(xiàn)代藥理研究已證實(shí)中醫(yī)藥對(duì)減輕炎癥反應(yīng)、改善心肌組織損傷等多個(gè)方面均具有效果［9-10］，藥物對(duì)缺血再灌注損傷的防治作用以其有效及可控性好等優(yōu)勢(shì)得到研究者的廣泛重視［11］。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心肌梗死屬“胸痹”范疇，張仲景在《金匱要略》中提到“夫脈，當(dāng)取太過不及。陽(yáng)微陰弦，即胸痹而痛”。所以胸痹病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)：其中本虛則以氣虛、陰傷為主，氣虛無力行血，陰傷即津液、精血虧虛，不足以濡養(yǎng)心神，氣陰雙虧，使心脈失養(yǎng)，不榮則痛。標(biāo)實(shí)主要以痰瘀互結(jié)為主，氣為血之帥，由于氣虛導(dǎo)致機(jī)體推動(dòng)、氣化無力，故瘀血停留，必然影響心主血脈之功能。氣虛也可導(dǎo)致機(jī)體津液轉(zhuǎn)運(yùn)、疏布、排泄異常，津液集聚，凝煉為痰，此外中氣虧虛，脾胃不能很好運(yùn)化水濕，也能聚濕生痰。瘀血疾濁互結(jié)，心脈氣機(jī)受阻而發(fā)生胸痹［12］。所以益氣養(yǎng)陰通脈為中醫(yī)治療胸痹的治療原則，雙參通脈顆粒是在益氣養(yǎng)陰通脈法的指導(dǎo)下，由人參、麥冬、當(dāng)歸、黃芪、丹參、川芎6味藥物組成，其中人參為大補(bǔ)元?dú)庵罚胄慕?jīng)，具有生津養(yǎng)血之功效；當(dāng)歸、丹參均可補(bǔ)血活血；人參、當(dāng)歸、黃芪配伍合用，共奏補(bǔ)益氣血之效。方中麥冬具有養(yǎng)陰生津的作用；川芎為血中之氣藥，具有良好的活血行氣之功效，與丹參、當(dāng)歸合用可增強(qiáng)其補(bǔ)血化瘀之功效，通達(dá)氣血，使補(bǔ)而不滯；黃芪在《神農(nóng)本草經(jīng)》中歸屬于上品，《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》謂其“能補(bǔ)氣，兼能生氣，善治胸中大氣下陷”，前期研究也證明，黃芪皂苷用于大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)，能改善心肌能量代謝，增強(qiáng)心肌收縮力，改善心肌缺血［13］。川芎可改善心肌細(xì)胞的肥大［14］。所以此方6味藥物通過益氣養(yǎng)陰、活血通脈標(biāo)本兼治的方法來達(dá)到治療心肌梗死的作用。本文觀察結(jié)果證實(shí)，雙參通脈顆粒對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有良好的療效，能有效降低心肌梗死后再灌注大鼠心肌細(xì)胞VCAM-1及TNF-α的含量，保護(hù)損傷的心肌組織，為其在臨床的推廣使用提供一定的理論依據(jù)。目前隨著中醫(yī)藥在臨床的應(yīng)用不斷發(fā)展，中醫(yī)藥治療已經(jīng)取得了一定的效果。許多臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明中藥有改善心肌缺血狀態(tài)，降低血管炎性反應(yīng)等作用［15］。以往臨床常以西藥作為主要治療方案，總體療效欠佳［16］。中藥將為心肌梗死的治療、提高患者生活水平提供新的途徑，對(duì)于臨床心肌缺血的治療有著重要的指導(dǎo)意義。