梁 旭 李 雁 李 昕

（北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700）

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是臨床常見的急危重癥，是由多種病因如感染、創(chuàng)傷等導致的以進行性呼吸困難、頑固性低氧血癥和肺組織水腫為主要特征的臨床綜合征［1］。ARDS的治療目前以保護性機械通氣、限制性液體管理等支持治療和控制原發(fā)病為主，臨床上多采用糖皮質(zhì)激素、一氧化氮吸入、肺表面活性物質(zhì)及對癥治療，但均無可靠的循證醫(yī)學證據(jù)。藥物等如β2受體激動劑、他汀類藥物和角質(zhì)形成細胞生長因子雖在動物實驗中取得了一定療效，但并未獲得滿意的臨床效果，且可能出現(xiàn)較嚴重的臨床副作用［2-4］。Meta分析研究表明，中西醫(yī)結(jié)合治療ARDS在降低病死率等方面優(yōu)勢明顯，中藥復方具有多靶點治療疾病的特點，相比單一的阻滯劑可能具有更好的臨床優(yōu)勢，對ARDS的防治具有廣闊的應(yīng)用前景［5］。

根據(jù)臨床表現(xiàn)，ARDS可歸屬于中醫(yī) “暴喘”“肺衰”等范疇。中醫(yī)學認為肺氣虛損，毒瘀互阻，進而導致肺氣衰敗是ARDS的關(guān)鍵病機［6］。目前，關(guān)于中醫(yī)藥治療ARDS的報道甚少，課題組在前期工作中采用國家級名老中醫(yī)杜懷棠教授經(jīng)驗方——益氣化瘀解毒方，以扶正祛邪為原則，從益氣、化瘀、解毒等方面對ARDS模型大鼠進行預(yù)防治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益氣化瘀解毒方可顯著減輕肺組織損傷程度，并可減低炎癥因子及關(guān)鍵炎癥蛋白的表達水平，但具體的作用機制尚未完全闡明［7-9］。

整合藥理學平臺（TCMIP，http：//www.tcmip.cn/）是整合了中藥成分、中藥材、中藥方劑、疾病/癥狀靶標等數(shù)據(jù)的中醫(yī)藥資源信息開源數(shù)據(jù)庫平臺，通過建立“中藥方劑-化學成分-作用靶標-疾病靶標”的多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)，構(gòu)建“中藥-成分-靶標-通路”復雜網(wǎng)絡(luò)，為中藥復方的作用機制研究提供了新思路［10］。本研究基于整合藥理學原理，對課題組前期有效方益氣化瘀解毒方中的益氣化瘀藥對——“黃芪-三七”進行研究，構(gòu)建其干預(yù)ARDS作用機制的分子網(wǎng)絡(luò)，為深入研究該復方治療ARDS的機理和進一步闡述ARDS的發(fā)病機制提供科學依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)來源與方法

1.1 “黃芪-三七”化學成分收集 TCMIP中藥材數(shù)據(jù)庫依據(jù)《中國藥典》（2015年版），收錄了400余味常用中藥材信息［10］。在其中藥信息設(shè)定界面對“黃芪”“三七”進行檢索并收集其所有化學成分，建立“黃芪-三七”藥對化學成分信息數(shù)據(jù)庫。

1.2 ARDS疾病候選靶標收集 在整合藥理學平臺疾病靶標信息數(shù)據(jù)檢索界面，以急性呼吸窘迫綜合征的英文縮寫“ARDS”作為關(guān)鍵詞進行檢索，可收集到疾病靶標數(shù)據(jù)庫中目前已知的ARDS治療靶點，作為“黃芪-三七”藥對的候選治療靶標。

1.3 靶標預(yù)測 TCMIP平臺利用Open Babel軟件對中藥成分進行二維結(jié)構(gòu)相似性檢索，通過在中藥靶標預(yù)測界面選取相似性分數(shù)≥0.8的所有藥物靶標作為“黃芪-三七”藥對的潛在作用靶標，建立藥物候選靶標信息數(shù)據(jù)庫［11］。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息（PPI） TCMIP整合了 HAPPI、InAct、HPRD、Reactome、OPHID、MINT，PDZ Base，DIP等數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息。通過該平臺的PPI數(shù)據(jù)庫，可獲得“黃芪-三七”藥對作用的潛在靶標與ARDS疾病靶標之間的PPI。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 通過網(wǎng)絡(luò)分析，計算“黃芪-三七”藥對潛在靶標與治療ARDS的疾病靶標之間的PPI信息網(wǎng)絡(luò)特征值，以節(jié)點連接度（degree）的2倍中位數(shù)為卡值，選取中藥靶標-疾病靶標互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點；在此基礎(chǔ)上，以節(jié)點連接度、節(jié)點緊密度和節(jié)點介度的中位數(shù)為卡值，選取同時滿足3個卡值的節(jié)點為“黃芪-三七”藥對潛在靶標-ARDS疾病靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點［12］。通過基因功能和通路的富集分析，挖掘分析“黃芪-三七”藥對治療ARDS關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標及其對應(yīng)的活性成分，并構(gòu)建 “中藥-核心成分-關(guān)鍵靶標-主要通路”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，進一步明確中藥干預(yù)疾病的作用機制。

1.6 關(guān)鍵靶標分析及通路富集 TCMIP整合基因本體數(shù)據(jù)庫 GO（http：//www.gene ontology.org/）和 KEGG通路數(shù)據(jù)庫（http：//www.kegg.jp）資源，可直接提取靶標基因或蛋白質(zhì)的分子功能、細胞內(nèi)定位及其所參與的生物學反應(yīng)和通路，對“黃芪-三七”藥對干預(yù)ARDS的關(guān)鍵作用靶標進行基因功能分析和通路富集分析，并將GO和KEGG計算分析的結(jié)果以P值降序的方式排列顯示。

2 結(jié) 果

2.1 “黃芪-三七”藥對化學成分靶標預(yù)測及分析 通過TCMIP數(shù)據(jù)庫共收集得到黃芪化合物成分29個，主要為黃芪皂苷類和黃芪多糖類；三七化合物成分95個，主要為三七皂苷、人參皂苷、西洋參皂苷和氨基酸類。研究表明，黃芪甲苷Ⅳ抑制脂多糖（LPS）處理的小鼠中的NF-κB激活和炎性基因表達［13］；黃芪多糖通過阻斷NF-κB活化抑制TNF-α處理的人血管內(nèi)皮細胞中ICAM-1和VCAM-1的表達［14］；三七中的人參皂苷Rb1可通過減少ICAM-1和ICAM-1基因的表達，改善肺微血管內(nèi)皮細胞間連接，減輕肺損傷［15］。針對上述成分，共預(yù)測出黃芪的潛在作用靶標1 273個，三七的潛在作用靶標626個，經(jīng)相似性分數(shù)≥0.8篩選后，得到黃芪預(yù)測靶標185個，三七預(yù)測靶標86個，二者共有的靶標71個，提示黃芪和三七在共性靶標之間存在潛在的疊加作用。

對“黃芪-三七”藥對候選靶標進行基因分析，取P值排名前20得到候選靶標具有的基因功能信息見表1，可見其功能涉及鈉離子通道復合體、突觸后膜電位的調(diào)節(jié)、細胞線粒體功能、電壓門控鈉通道活性、離子跨膜轉(zhuǎn)運調(diào)控、動作電位下的膜去極化、神經(jīng)元動作電位、心肌細胞膜去極化的調(diào)節(jié)、肉堿代謝過程、痛覺感覺等條目。對“黃芪-三七”候選靶標進行通路富集分析，取P值排名前20得到候選靶標參與的通路信息見表2，可見涉及通路主要有循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、PPAR信號通路、內(nèi)分泌系統(tǒng)、過氧化物酶體、脂質(zhì)代謝、心肌細胞腎上腺素能信號轉(zhuǎn)導、輔助因子和維生素的代謝、脂肪酸代謝、甘油磷脂代謝、半乳糖代謝、α-亞麻酸代謝等。

表1 “黃芪-三七”藥對候選靶標具有的功能信息

2.2 “黃芪-三七”藥對治療ARDS的核心靶標網(wǎng)絡(luò)通過TCMIP的PPI相互作用數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建 “黃芪-三七”藥對的潛在靶標與疾病靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)條件篩選出關(guān)鍵靶標655個，根據(jù)degree排序僅顯示排名前100的靶點，得到“黃芪-三七”治療ARDS的候選靶標網(wǎng)絡(luò)，見圖1。圖中節(jié)點的大小與degree成正比關(guān)系，其中已知治療ARDS的直接靶標78個，潛在藥物靶標3個，共同靶標2個。根據(jù)比較網(wǎng)絡(luò)中每條邊的介度值，發(fā)現(xiàn)TSC1、NSDHL、PIK3R1等靶標的節(jié)點介度值更大，在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用也更大。

表2 “黃芪-三七”藥對候選靶標參與的通路信息

圖1 “黃芪-三七”藥對干預(yù)ARDS的候選靶標網(wǎng)絡(luò)

以上關(guān)鍵靶標中，部分已知疾病靶標如：前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）主要與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)節(jié)、NF-κB進入細胞核的正向調(diào)節(jié)、對腫瘤壞死因子的反應(yīng)、炎癥細胞遷移的正調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮生長因子生成的正調(diào)控、血小板衍生生長因子產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)、細胞對流體剪切應(yīng)力的反應(yīng)、細胞對缺氧的反應(yīng)、細胞周期的負向調(diào)控；絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶A-Raf（ARAF）功能涉及ATP結(jié)合、蛋白激酶活性、受體信號傳導蛋白質(zhì)活性、金屬離子結(jié)合等；絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PP1-γ催化亞基（PPP1CC）與有絲分裂細胞周期、轉(zhuǎn)化生長因子β受體信號通路、小GTP酶介導的信號轉(zhuǎn)導、蛋白質(zhì)去磷酸化、細胞分裂、三酰甘油分解代謝過程相關(guān)。潛在藥物靶標：鈉/鉀轉(zhuǎn)運ATP酶亞基α-1（ATP1A1）功能主要與ATP結(jié)合、磷酸酶活性、鈉鉀離子結(jié)合相關(guān)；過氧化物酶體肉毒堿O-辛?；D(zhuǎn)移酶 （CROT）功能主要涉及脂肪酸β-氧化、細胞脂質(zhì)代謝過程、輔酶A代謝過程產(chǎn)生前體代謝物和能量等；肉堿O-棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（CPT1A），主要與細胞脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)同源寡聚化、脂肪酸β-氧化、上皮細胞分化等功能相關(guān)。共同靶標2個：葡萄糖激酶（GCK），功能主要涉及ATP結(jié)合及葡萄糖的結(jié)合；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶D1（YWHAE），功能主要與離子通道結(jié)合、蛋白質(zhì)活性、MHCⅡ類蛋白質(zhì)復合物結(jié)合、酶結(jié)合、RNA結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白激酶C活性等相關(guān)。

ARDS的發(fā)病機制較為復雜，其肺損傷過程涉及多個病理環(huán)節(jié)的不同分子作用過程。上述靶標涉及諸多生理病理分子機制，主要與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮生長因子調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)相互作用及代謝、細胞生長和死亡、信號因子的正負調(diào)節(jié)等相關(guān)，這不僅說明了ARDS的發(fā)病機制復雜，同時說明“黃芪-三七”藥對干預(yù)ARDS的作用主要是通過對炎癥反應(yīng)-血管內(nèi)皮功能-細胞生長及死亡的多靶點、網(wǎng)絡(luò)狀的綜合調(diào)控而實現(xiàn)。

2.3 “黃芪-三七”藥對治療ARDS關(guān)鍵靶標的GO基因功能分析 “黃芪-三七”藥物靶標與疾病靶標基因功能主要涉及細胞質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)結(jié)合、細胞核核質(zhì)、血小板活化、ATP結(jié)合、蛋白質(zhì)磷酸化、轉(zhuǎn)錄模板DNA的正向調(diào)控、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、蛋白激酶結(jié)合及活性、有絲分裂細胞周期的G2/M轉(zhuǎn)換、凋亡過程的負調(diào)控、肽基絲氨酸磷酸化等，見表3。

2.4 “黃芪-三七”藥對治療ARDS的KEGG通路富集分析 根據(jù)P值排序僅顯示排名前20的KEGG通路，見表4。通路富集分析結(jié)果顯示，“黃芪-三七”藥對治療ARDS的主要作用通路有細胞生長與死亡、ErbB信號通路、FoxO信號轉(zhuǎn)導通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號轉(zhuǎn)導通路、細胞間通訊、癌癥信號通路、細胞周期、內(nèi)分泌系統(tǒng)、胰腺癌、傳染性疾病、甲狀腺激素信號通路、前列腺癌、HTLV-Ⅰ感染等。

表3 “黃芪-三七”藥對治療ARDS關(guān)鍵靶標基因信息功能分析

表4 “黃芪-三七”藥對治療ARDS關(guān)鍵靶標通路信息

2.5 “黃芪-三七”藥對治療ARDS的“中藥-成分-靶標-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析 如圖2。通過TCMIP數(shù)據(jù)庫分析可以看出，“黃芪-三七”藥對治療ARDS作用主要與52個化學成分相關(guān)聯(lián)，其中黃芪成分17個，三七成分34個，共有成分1個。黃芪成分以黃芪皂苷和黃芪苷為主，如黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ等；三七主要成分以三七皂苷為主， 如三七皂苷 A、B、C、D、E、F、G、H、R1、R4，人參皂苷 Rc、Rg1，西洋參皂苷Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ等。共有成分為十六烷酸（棕櫚酸）。

圖2 “黃芪-三七”藥對干預(yù)ARDS“中藥-成分-靶標-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析

其中，黃芪皂苷、三七皂苷、人參皂苷均已通過實驗證實具備減輕急性肺損傷（ALI）的藥理作用。張吉等發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可能通過抑制GRP78和CHOP蛋白表達調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，改善急性肺損傷狀態(tài)［16］；趙建軍等觀察到黃芪甲苷能上調(diào)LPS致ALI大鼠肺水通道蛋白5的表達從而減輕LPS致ALI大鼠肺炎癥損傷反應(yīng)［17］；徐旭等發(fā)現(xiàn)黃芪皂苷可顯著延長電刺激大鼠頸總動脈形成血栓的時間，并能抑制血小板聚集，提高前列環(huán)素和一氧化氮（NO）水平，降低血栓素A2/前列環(huán)素比例，從而抗血栓形成［18］；劉永琦、李金田等發(fā)現(xiàn)黃芪皂苷調(diào)節(jié)Th1/Th2型細胞因子的平衡及TNF-α含量可能是其抗肺纖維化的機理之一［19］；陳宇清等發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可以明顯降低ALI大鼠的血清和BALF中的TNF-α、IL-6及-IL-10水平，有助于減緩或阻止ALI向ARDS發(fā)展［20］。人參皂苷具有擴張血管、改善微循環(huán)、抑制血小板的聚集，促進血管內(nèi)皮細胞功能的恢復，調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)，抗氧化、改善微循環(huán)、清除氧自由基、誘導細胞凋亡、抗組織損傷、抗腫瘤等藥理作用［21］。鞏秀麗研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷液可減緩ALI大鼠的呼吸窘迫程度，改善肺通氣和減輕肺水腫，通過抑制大鼠肺組織中 SP-A蛋白和SP-B蛋白含量的降低來治療 ALI［22］。

“黃芪-三七”藥對作用于ARDS的相關(guān)通路主要有MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、ErbB信號通路、FoxO信號轉(zhuǎn)導通路、細胞生長及死亡、非小細胞型肺癌、細胞循環(huán)、細胞通訊、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、感染性疾病、HTLV-1感染、結(jié)直腸癌、胰腺癌、甲狀腺激素信號通路、雌激素信號通路等。

其中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路與各種細胞功能相關(guān)，包括細胞增殖，分化和遷移［23］。正常表達的MAPK相關(guān)蛋白分子包括細胞外信號相關(guān)激酶 （ERK）、Jun 氨基末端激酶 （JK1/2/3）、p38 蛋白和ERK5，IL-8可通過MAPK和PI3K信號通路誘發(fā)細胞趨化作用所需的黏附分子如整合蛋白MAC-1的表達。MAPK通路及PI3K通路亦可通過G蛋白等分子相聯(lián)通［24］。

磷脂酰肌醇3′-激酶（PI3K）-Akt信號傳導通路可被多種類型的細胞刺激或毒性損傷激活，主要與細胞轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖、生長和存活等相關(guān)，參與細胞凋亡、蛋白質(zhì)合成與代謝等細胞周期過程［25］。

ErbB受體酪氨酸激酶（RTK）家族將細胞外生長因子配體與細胞內(nèi)信號通路結(jié)合，調(diào)節(jié)多種生物反應(yīng)，包括增殖、分化、細胞運動和存活［26］。RTK家族成員之一表皮生長因子受體（EGFR，也稱為ErbB-1或HER1），可誘導受體同源二聚體和異二聚體的形成以及內(nèi)在激酶結(jié)構(gòu)域的激活，進而誘導各種信號傳導途徑［27］。MAPK途徑是所有ErbB受體下游的共同靶標，同時PI3K途徑可被大多數(shù)ErbB直接或間接激活。

FoxO信號轉(zhuǎn)導通路參與調(diào)節(jié)細胞生理過程中特定基因的表達，包括細胞凋亡，細胞周期控制，葡萄糖代謝，抗氧化應(yīng)激等［28］。FoxO蛋白的中心調(diào)節(jié)機制與胰島素、生長因子及PI3K下游的絲氨酸-蘇氨酸激酶Akt/蛋白激酶 B（Akt/PKB）的磷酸化相關(guān)［29］。

以上信號通路之間通過ERK、Akt等關(guān)鍵蛋白相互聯(lián)系溝通，形成了ARDS發(fā)病過程中的復雜分子通路，通過對 “中藥-成分-靶標-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)“黃芪-三七”藥對成分在干預(yù)ARDS病程進展中發(fā)揮了重要作用，其調(diào)控炎癥反應(yīng)、抗細胞凋亡及保護肺血管內(nèi)皮細胞的分子機制與課題組前期實驗結(jié)果具有很高的吻合度［7-9］。

3 結(jié) 論

網(wǎng)絡(luò)藥理學注重整體性和動態(tài)性的特點，與中藥復方注重多組分配伍、多靶點干預(yù)及系統(tǒng)調(diào)控的思想不謀而合［30］。TCMIP結(jié)合大數(shù)據(jù)和模型計算，應(yīng)用人工智能、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)科學構(gòu)建了智能化和網(wǎng)絡(luò)化平臺，為中藥復方及經(jīng)方藥對的研究提供了新思路和新方法。

益氣化瘀解毒方在防治ARDS的前期動物實驗中作用明顯，“黃芪-三七”作為益氣化瘀核心藥對作用突出，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學研究技術(shù)，發(fā)現(xiàn)“黃芪-三七”藥對主要活性成分可針對多個靶點、多條通路發(fā)揮干預(yù)ARDS的作用，其作用可能與 TSC1、NSDHL、PIK3R1等關(guān)鍵靶標及MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、ErbB信號通路、FoxO信號轉(zhuǎn)導通路等有關(guān)，這些靶點及通路與文獻報道的急性肺損傷的發(fā)病機制及課題組的前期研究成果多有吻合。本研究是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學原理的綜合數(shù)據(jù)分析，具體機制及物質(zhì)基礎(chǔ)還將通過實驗加以驗證，望本研究能夠為復方核心藥對的進一步研究及ARDS的臨床治療提供參考。本研究表明，“黃芪-三七”藥對可通過多靶點、多途徑干預(yù)ARDS，為其進一步的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)分析和防治作用機制研究提供了依據(jù)。