楊 強(qiáng)，欽丹萍，楊新艷，岑 剛，代 群，張春麗，汪 瑤

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 2.消化內(nèi)科、3.胃腸研究實(shí)驗(yàn)室、4.病理科，浙江 杭州 310006)

雷公藤多苷(Tripterygiumwilfordiipolycoride，TWP)具有免疫調(diào)控及抗炎作用，在臨床上被應(yīng)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病[1]。在臨床中，我們觀察到TWP對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)具有良好的療效，與硫唑嘌呤(azathioprine，AZA)等免疫抑制劑相比，其副反應(yīng)低[2]，且細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，TWP具有良好的抗炎作用[3]。由此，我們開(kāi)展了相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，其中表達(dá)譜分析顯示，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)中的FasL在UC大鼠結(jié)腸炎癥活動(dòng)時(shí)表達(dá)上調(diào)，在TWP干預(yù)時(shí)表現(xiàn)為下調(diào)的趨勢(shì)。為此，本實(shí)驗(yàn)以real-time PCR法對(duì)FasL的這種改變加以明確與驗(yàn)證，并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行信號(hào)通路分析，并篩選出相關(guān)分子，用real-time PCR法驗(yàn)證，并對(duì)該信號(hào)通路的相關(guān)分子及末端炎癥因子進(jìn)行檢測(cè)，以此探討Fas/FasL及其相關(guān)信號(hào)通路p38 MAPK在2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS)/乙醇UC大鼠模型中的表達(dá)變化及TWP對(duì)其的影響。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡SPF級(jí)♂Wistar健康大鼠90只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2藥物與試劑雷公藤多苷片(生產(chǎn)批號(hào)：1311108B，浙江得恩德制藥有限公司)；硫唑嘌呤(生產(chǎn)批號(hào)：008953，Aspen公司)。TNBS(Sigma公司)；FasL、MAPK14(p38α)、MAPK13(p38δ)引物，由上海伯豪生物技術(shù)有限公司合成；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1 beta，IL-1β)PCR引物，由TaKaRa公司合成；RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；IL-1β抗體(Abcam公司)；TNF-α抗體(R&D公司)。

1.3儀器PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystems公司)；電泳儀及電泳槽(Bio-Rad公司)；GeneChip?Scanner 3000(Affymetrix公司)；Odyssey曝光機(jī)(LI-COR公司)。

2 方法

2.1造模及給藥90只♂Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、TWP低、中、高劑量組、AZA組，每組15只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除正常組外，其余各組大鼠均按每只大鼠100 mg·kg-1TNBS+0.25 mL 50%乙醇進(jìn)行灌腸，制備UC大鼠模型。正常組、模型組給予10 mL·kg-1生理鹽水灌胃；TWP低、中、高劑量組：分別按3、6、12 mg·kg-1的劑量配制成0.3、0.6、1.2 g·L-1TWP的混懸液，按10 mL·kg-1灌胃；AZA組：按6 mg·kg-1的劑量配制成0.6 g·L-1AZA的混懸液，按10 mL·kg-1灌胃；給藥時(shí)間2周，末次給藥24 h后處死大鼠。

2.2標(biāo)本采集與處理留取大鼠距肛門(mén)4～12 cm處，長(zhǎng)約8 cm的新鮮結(jié)腸標(biāo)本，參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)分別行結(jié)腸組織大體形態(tài)損傷評(píng)分[4]及光學(xué)顯微鏡下結(jié)腸組織病理?yè)p傷評(píng)分[5]。并將所取的結(jié)腸標(biāo)本放入凍存管，置-80 ℃冰箱中保存。

2.3Fas/FasL表達(dá)譜分析用Affymetrix表達(dá)譜配套的試劑盒GeneChip 3′ IVT PLUS Reagent Kit，按照規(guī)范化流程對(duì)樣品總RNA中的mRNA行放大、標(biāo)記與純化，獲得帶有生物素標(biāo)記的cRNA。按照Affymetrix表達(dá)譜芯片配套提供的流程和試劑盒來(lái)完成雜交洗滌的工作。采用GeneChip?Scanner 3000掃描芯片結(jié)果，用Command Console Software 4.0軟件讀取原始數(shù)據(jù)，合格的數(shù)據(jù)再進(jìn)一步采用Gene Spring Software 11.0行歸一化處理，MAS5.0為所用算法。選取標(biāo)本為正常組、模型組、TWP高劑量組和AZA組。

2.4Real-timePCR驗(yàn)證靶基因FasL表達(dá)水平按RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，并對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參。FasL引物序列：5′-CATAAAGTTTTGGGCTGCTGTGT-3′(上游)，5′-TGCTCTTGGCCATTTAACATCA-3′(下游)。靶基因的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt的形式表達(dá)。

2.5通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因Fas/FasL的信號(hào)通路分析通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Fas/FasL的信號(hào)通路分析，揭示靶基因Fas/FasL參與UC炎癥活動(dòng)時(shí)可能涉及的信號(hào)通路，并在表達(dá)譜芯片(過(guò)程同“2.3”，選用標(biāo)本亦同F(xiàn)as/FasL)中篩選信號(hào)通路中相關(guān)分子(MAPK14、MAPK13)，并用real-time PCR法加以驗(yàn)證(過(guò)程同“2.4”)。引物序列：MAPK14(p38α)：5′-GGCCTCACCGCCTCAGTAT-3′(上游)，5′-CCCAGACGTTGCTACTAACCATT-3′(下游)；MAPK13(p38δ)：5′-GCTGAGGGCCTTATAGGGAATG-3′(上游)，5′-CAAAAAGGTAAAAGGCAGTCATCTC-3′(下游)。以β-actin為內(nèi)參，MAPK14(p38α)、MAPK13(p38δ)的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt來(lái)表示。

2.6RT-PCR法測(cè)定p38MAPK信號(hào)通路末端炎癥因子TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)所取標(biāo)本按RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，并對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列：TNF-α：5′-TCAGTTCCATGGCCCAGAC-3′(上游)，5′-GTTGTCTTTGAGATCCATGCCATT-3′(下游)；IL-β：5′-CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA-3′(上游)，5′-CCCAAGTCAAGGGCTTGGAA-3′(下游)；β-actin：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′(上游)，5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′(下游)。

2.7Westernblot法測(cè)定p38MAPK信號(hào)通路末端炎癥因子TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)將所取腸組織標(biāo)本研磨粉碎后，加入6倍劑量的冷蛋白裂解液[20 mmol·L-1Tris/HCl(pH 7.5)、10 mmol·L-1胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶(APMSF)、1 mmol·L-1EDTA抗原修復(fù)液、1 mmol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)]；取一定量蛋白上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶封閉2 h，加入TNF-α(1 ∶5 000)、IL-1β(1 ∶2 500)單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜5 min×3次。分別加入相應(yīng)熒光二抗，室溫緩慢震搖2 h，TBST洗膜5 min×3次。采用Odyssey曝光機(jī)進(jìn)行圖像顯影，Odyssey軟件進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析，目的蛋白的表達(dá)以目的蛋白的灰度值與β-actin灰度值的比值表示。

3 結(jié)果

3.1UC模型大鼠結(jié)腸炎癥評(píng)分如Fig 1所示，治療14 d后，模型組大鼠大體形態(tài)損傷以及組織病理?yè)p傷評(píng)分與正常組相比明顯升高(P<0.01)；TWP高劑量組、AZA組結(jié)腸炎癥評(píng)分較模型組均有明顯改善(P<0.01)。

Fig 1 The inflammatory scores of colon in each

##P<0.01vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3.2Fas/FasL表達(dá)譜分析結(jié)果及FasL相對(duì)表達(dá)量

3.2.1Fas/FasL表達(dá)譜分析結(jié)果 實(shí)驗(yàn)以倍數(shù)變化>2，P<0.05，表達(dá)值 > 7為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出的FasL呈現(xiàn)差異表達(dá)，而Fas未見(jiàn)明顯的差異性表達(dá)。Tab 1結(jié)果顯示，F(xiàn)asL的表達(dá)在模型組明顯高于正常組(P<0.05)，在TWP高劑量組、AZA組均低于模型組，其中AZA組與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；Fas的表達(dá)在模型組高于正常組(P>0.05)，在TWP高劑量組、AZA組高于模型組(P>0.05)，但其各組間的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tab 1 The gene expression profile analysis of Fas/FasL in colon of each

#P<0.05vsnormal；**P<0.01vsmodel

3.2.2FasL mRNA相對(duì)表達(dá)量 如Fig 2所示，F(xiàn)asL mRNA的相對(duì)表達(dá)量在模型組明顯高于正常組(P<0.01)；在TWP中、高劑量組、AZA組均明顯低于模型組(P<0.01)。

Fig 2 Relative mRNA expression of FasL detected by real-time PCR in colon of each

##P<0.01vsnormal;**P<0.01vsmodel

3.2.3Fas/FasL信號(hào)通路分析 針對(duì)Fas/FasL，在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中行信號(hào)通路分析，結(jié)果提示Fas/FasL調(diào)節(jié)UC炎癥活動(dòng)可能涉及到p38 MAPK信號(hào)通路。

3.3p38MAPK信號(hào)通路中相關(guān)分子表達(dá)譜分析及相對(duì)表達(dá)量

3.3.1p38 MAPK信號(hào)通路分子的表達(dá)譜分析結(jié)果 如Tab 2所示，MAPK14(p38α)的表達(dá)在模型組明顯高于正常組(P<0.05)，在TWP高劑量組、AZA組均明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)；而MAPK13(p38δ)的表達(dá)在模型組明顯低于正常組(P<0.01)，在TWP高劑量組、AZA組均明顯高于模型組(P<0.05)。

Tab 2 The gene expression profile analysis of MAPK14 and MAPK13 in colon of each

#P<0.05,##P<0.01vsnormal；*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3.3.2p38 MAPK信號(hào)通路分子mRNA的相對(duì)表達(dá)量 如Fig 3所示，MAPK14(p38α)mRNA的相對(duì)表達(dá)量在模型組明顯高于正常組(P<0.01)，在TWP低、高劑量組、AZA組均明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)；而MAPK13(p38δ)mRNA的相對(duì)表達(dá)量在模型組明顯低于正常組(P<0.01)，在TWP低、中、高劑量組、AZA組均明顯高于模型組(P<0.01)。

Fig 3 Relative mRNA expression of MAPK14 and MAPK13 detected by real-time PCR in colon of each

##P<0.01vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3.4p38MAPK信號(hào)通路中末端炎癥因子TNF-α、IL-1βmRNA及蛋白的表達(dá)RT-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 4、5)，TNF-α、IL-1β mRNA及蛋白的表達(dá)在模型組均明顯高于正常組(P<0.01)，在TWP高劑量組、AZA組均明顯低于模型組(P<0.01)，TWP高劑量組與AZA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Fig 4 Relative mRNA expression of TNF-α and IL-1β detected by RT-PCR in colon of each

##P<0.01vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 5 Expression of TNF-α and IL-1β protein detected by Western blot in colon of each

##P<0.01vsnormal;**P<0.01vsmodel

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用TNBS/乙醇法建立UC大鼠模型，造模后模型組大鼠結(jié)腸大體形態(tài)損傷評(píng)分、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分均高于正常組。另外，在結(jié)腸炎癥評(píng)分方面，TWP高劑量組及AZA組與模型組比較均有明顯優(yōu)勢(shì)，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示TWP能夠改善UC大鼠的結(jié)腸炎癥活動(dòng)，其作用與AZA相當(dāng)。

Fas是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體族的膜蛋白分子，是一種Ⅰ型跨膜蛋白；FasL是Fas的天然配體，是II型跨膜糖蛋白分子；Fas與FasL結(jié)合能夠活化Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(Fas-associated death domain，F(xiàn)ADD)及下游的caspases家族，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。有研究顯示[7]，在UC患者腸組織中，F(xiàn)asL陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，與表達(dá)Fas的結(jié)腸上皮細(xì)胞結(jié)合即可引起其大量凋亡，破壞腸黏膜屏障，導(dǎo)致腸黏膜損傷和潰瘍，從而參與UC的發(fā)病。

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8]，在結(jié)腸組織中，F(xiàn)asL主要表達(dá)于激活的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞，其在活動(dòng)性UC中呈高表達(dá)；而Fas則主要表達(dá)于結(jié)腸上皮細(xì)胞，其在正常與UC結(jié)腸中均呈保守表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)譜分析提示FasL在模型組中的表達(dá)高于正常組，在TWP高劑量組及AZA組中，其表達(dá)較模型組均呈下調(diào)趨勢(shì)，其中AZA組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而Fas的表達(dá)在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相一致。針對(duì)FasL行real-time PCR檢測(cè)，驗(yàn)證了其在表達(dá)譜分析中的變化趨勢(shì)：FasL的相對(duì)表達(dá)量在模型組高于正常組，在TWP中、高劑量組及AZA組中均低于模型組(P<0.01)，TWP高劑量組略好于AZA組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在UC結(jié)腸組織中FasL的表達(dá)呈升高趨勢(shì)，而TWP可以下調(diào)其表達(dá)。

除了參與細(xì)胞凋亡外，F(xiàn)as/FasL在促炎癥反應(yīng)中同樣扮演了重要角色。目前，相關(guān)研究表明，F(xiàn)as/FasL能夠通過(guò)MyD88依賴途徑、募集中性粒細(xì)胞等非凋亡相關(guān)途徑介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，但其機(jī)制研究尚不深入[9-10]。在此基礎(chǔ)上，我們針對(duì)Fas/FasL行信號(hào)通路分析獲知，F(xiàn)as/FasL參與UC疾病活動(dòng)時(shí)，其途徑可能涉及p38 MAPK信號(hào)通路。有研究表明[11-12]，F(xiàn)as/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與p38 MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)。此外，p38 MAPK信號(hào)通路能通過(guò)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)炎癥因子進(jìn)行調(diào)控，在UC的疾病進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[13]。p38 MAPK共有4個(gè)亞型，其中MAPK14(p38α)、MAPK13(p38δ)在腸組織中都有表達(dá)，特別是MAPK14(p38α)與UC的相關(guān)性最為密切[13]，其被MAPK激酶MKK3和MKK6通過(guò)雙磷酸化途徑激活后，可通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)途徑調(diào)控TNF-α、IL-1β等促炎性細(xì)胞因子的釋放[14-15]，而這些促炎因子是UC發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因子。Waetzig等[13]以MAPK14(p38α)抑制劑SB203580孵育UC患者腸黏膜活檢組織培養(yǎng)液，其TNF-α的含量明顯下降，且與SB203580濃度呈正相關(guān)。上述研究反映了p38 MAPK家族中的MAPK14(p38α)亞型在p38 MAPK信號(hào)通路中的重要作用。

本實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)譜分析顯示，MAPK14(p38α)在模型組中的表達(dá)高于正常組，在TWP高劑量組、AZA組中低于模型組，real-time PCR驗(yàn)證了這種表達(dá)趨勢(shì)。提示TWP和AZA對(duì)MAPK14(p38α)的表達(dá)均有抑制作用，TWP抑制作用略好于AZA，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與此相對(duì)應(yīng)的是，p38 MAPK信號(hào)通路中末端炎癥因子TNF-α、IL-1β mRNA及蛋白的表達(dá)在模型組均明顯高于正常組；在TWP高劑量組及AZA組均明顯低于模型組，提示TWP能夠抑制該信號(hào)通路末端炎癥因子的表達(dá)。

因此，我們推測(cè)TWP能夠通過(guò)Fas/FasL系統(tǒng)及其所介導(dǎo)的p38 MAPK信號(hào)通路，對(duì)UC的炎癥活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控，從而發(fā)揮抗炎作用；其中與MAPK14(p38α)這個(gè)亞型的相關(guān)性較大。此外，本研究提示MAPK13(p38δ)在UC炎癥活動(dòng)時(shí)呈低表達(dá)，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]；而在TWP、AZA治療后其表達(dá)均高于模型對(duì)照組，但目前MAPK13(p38δ)對(duì)炎癥的作用還難以確定，這其中的機(jī)制有待我們進(jìn)一步研究。

(致謝: 本文實(shí)驗(yàn)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心及浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸研究實(shí)驗(yàn)室完成，感謝對(duì)實(shí)驗(yàn)給予幫助的老師和同學(xué)。)