許文虎，金春子，王曉龍，陳 晨，崔 蘭

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 1. 心血管內(nèi)科、2. 中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉 133000)

動脈粥樣硬化是一種以動脈血管壁內(nèi)脂質(zhì)斑塊不斷累積為特征的慢性、進(jìn)展性疾病[1-2]。在動脈粥樣硬化的發(fā)病及外周血管疾病、腦卒中、冠狀動脈疾病等并發(fā)癥產(chǎn)生過程中，病理性血脂因素已經(jīng)成為了關(guān)鍵的危險(xiǎn)因素[3-4]。血脂異常一般是指血中致動脈粥樣硬化的脂質(zhì)——總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、三酰甘油、載脂蛋白B和脂蛋白A增高，而抗動脈粥樣硬化的脂質(zhì)——高密度脂蛋白膽固醇和載脂蛋白A降低。大量循證醫(yī)學(xué)資料證明，積極調(diào)脂治療可明顯減少致死性和非致死性心肌梗死發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，以及冠心病的致殘率和致死率，并降低對經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和冠脈旁路移植術(shù)的需求，調(diào)脂治療已成為動脈粥樣硬化預(yù)防策略中最重要的措施之一[5-6]。棕櫚酸(palmitic acid，PA)又稱軟脂酸，是一種飽和高級脂肪酸，以甘油酯的形式普遍存在于動植物油脂中，在自然界中分布很廣，通常用于建立脂毒性細(xì)胞模型和動物模型。因此，本研究以PA誘導(dǎo)建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)脂毒性損傷模型，分析其機(jī)制與線粒體凋亡通路的相關(guān)性，為內(nèi)皮細(xì)胞脂毒性損傷研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 HUVECs購自上?；鈱?shí)業(yè)有限公司。

1.1.2試劑 凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)、細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax抗體，均購自美國Abcam公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自羅氏公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒、MTT檢測試劑盒，均購自碧云天公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶，均購自美國Gibco公司； PA、線粒體通透性抑制劑環(huán)孢素A (ciclosporine A，CsA)，均購自Sigma公司。

1.1.3儀器 電泳槽、電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；多功能酶標(biāo)儀(上海沛歐分析儀器有限公司)；熒光顯微鏡、倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(上海皓莊儀器有限公司)；紫外分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司)。

1.2方法

1.2.1PA的配制 水浴鍋溫度保持至37 ℃，稱取PA溶于無水乙醇中，使母液濃度達(dá)到100 mmol·L-1，-20 ℃長期保存，避免反復(fù)凍融,可少量多管分裝?；蛟?7 ℃水浴條件下，將其溶于0.5% BSA的高糖DMEM(含血清、雙抗)，渦旋混勻，濾膜過濾后使用，4 ℃冰箱保存。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出細(xì)胞，接種于DMEM高糖培養(yǎng)基(含25 mmol·L-1的葡萄糖、10%胎牛血清、100×青霉素-鏈霉素溶液)中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h后，更換培養(yǎng)液，直至細(xì)胞生長密度達(dá)到70%～80%時(shí)，用0.25% 含EDTA的胰酶輕輕吹打消化、傳代至所需培養(yǎng)皿中，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分組分三類：濃度梯度測試PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)；時(shí)間梯度測試(0、12、24、48 h)；抑制劑實(shí)驗(yàn)分為對照組，0.4 mmol·L-1PA組，以及10 μmol·L-1CsA預(yù)處理2 h后，再給予0.4 mmol·L-1PA組。

1.3檢測指標(biāo)

1.3.1MTT檢測細(xì)胞增殖率 以每孔含1×106個(gè)細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)，接種于96孔板中(設(shè)立6個(gè)復(fù)孔)，置CO2培養(yǎng)箱孵育，待細(xì)胞貼壁牢固，換為含PA的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至所設(shè)定時(shí)間，然后吸棄上清液，每孔加入5 g·L-1的MTT 20 μL，將96孔板放置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀測各孔OD值。細(xì)胞活力=OD處理孔/OD陰性對照孔×100%。

1.3.2ROS含量的檢測 HUVECs接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至70%～80%融合度，按組別給藥后，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，PBS反復(fù)沖洗后，細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入10 mmol·L-1DCFH-DA，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，PBS反復(fù)沖洗后，采用熒光顯微鏡進(jìn)行拍照，并用ImageJ 1.41軟件分析綠色熒光強(qiáng)度。

1.3.3Western blot法檢測線粒體凋亡通路蛋白表達(dá)水平 把分組好的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞放5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后，PBS洗去細(xì)胞雜質(zhì)，每皿加入裂解液充分裂解細(xì)胞，細(xì)胞刮刀收集于離心管，離心后收集上清，用BCA試劑盒測定蛋白含量。根據(jù)所測濃度，等體積上樣于5%～15%的SDS-PAGE凝膠，電泳進(jìn)行分離，冰浴下濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜2 h，用5%的脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h，加入對應(yīng)一抗4 ℃搖床孵育過夜。次日換為HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光顯影，然后凝膠成像系統(tǒng)檢測AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin的表達(dá)水平。

1.3.4TUNEL檢測細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)皿細(xì)胞長滿到90%，胰酶消化細(xì)胞，收集于15 mL離心管，離心5 min，加入培養(yǎng)基使細(xì)胞被吹打成細(xì)胞懸液，每孔500 μL，接種于鋪有爬片的24孔板內(nèi)，放CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，給予PA，繼續(xù)孵育24 h，PBS反復(fù)沖洗后，4%多聚甲醛固定，采用TUNEL凋亡試劑盒染色，熒光顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察，進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1PA對HUVECs細(xì)胞增殖的影響體外培養(yǎng)細(xì)胞，用含PA (0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h。如Fig 1A所示，隨著PA濃度的增加，HUVECs增殖率呈下降趨勢，PA濃度在0.4 mmol·L-1時(shí)開始明顯降低(P<0.01)；Fig 1B結(jié)果顯示，含PA 0.4 mmol·L-1的DMEM培養(yǎng)基刺激細(xì)胞0、12、24、48 h后，隨著刺激時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，刺激細(xì)胞24 h后的數(shù)據(jù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中在刺激細(xì)胞24 h時(shí)，開始明顯降低(P<0.01)。因此，我們將PA濃度定為0.4 mmol·L-1，刺激時(shí)間定為24 h開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 1 Influence of PA on cell viability in HUVECs n=5)

A: Cell viability was significantly suppressed when PA concentration increased to 0.4 mmol·L-1.**P<0.01vs0 mmol·L-1group; B: HUVECs were treated with 0.4 mmol·L-1PA for different time, and inhibition of cell viability was calculated from MTT assay.##P<0.01vs0 h group

2.2PA刺激對HUVECs細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響如Fig 2所示，0.4 mmol·L-1PA刺激0、12、24、48 h 后，刺激時(shí)間在24～48 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS的水平出現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，而24 h PA刺激組與48 h PA刺激組之間的ROS水平差異無顯著性(P>0.05)。

Fig 2 Effects of PA on ROS of HUVECs (scale bar: 50 μm)

The intracellular level of ROS in HUVECs was estimated by DCFH-DA, a fluorescent probe. DHE is green fluorescence. Fluorescence images of HUVECs stained with DHE after cells were incubated for 0 h (A), 12 h (B), 24 h (C) and 48 h (D) with 0.4 mmol·L-1PA.

2.3PA對HUVECs細(xì)胞線粒體凋亡通路蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示，用含0.4 mmol·L-1PA的DMEM培養(yǎng)基刺激細(xì)胞24 h，與正常對照組相比，Bcl-2表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，而AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3、Bax等線粒體凋亡通路蛋白表達(dá)在高脂刺激24 h后均出現(xiàn)高表達(dá)，高于正常對照組(P<0.05)；而24、48 h PA刺激組之間的線粒體凋亡通路蛋白表達(dá)差異均無顯著性(P>0.05)。

2.4PA對HUVECs細(xì)胞凋亡的影響如Fig 4所示，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞的紅色熒光強(qiáng)度與給藥時(shí)間呈正比，隨著給藥時(shí)間的延長，紅色熒光增強(qiáng)，提示細(xì)胞凋亡增加。PA刺激24 h時(shí)，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的固縮現(xiàn)象，表現(xiàn)出明顯的凋亡相關(guān)形態(tài)學(xué)改變，其中PA刺激24 h與48 h相比，熒光強(qiáng)度差異無顯著性。

2.5線粒體凋亡通路與PA所致HUVECs細(xì)胞損傷的相關(guān)性如Fig 5所示，在顯微鏡下觀察到0.4 mmol· L-1PA刺激24 h時(shí)細(xì)胞的紅色熒光明顯增強(qiáng)，提示細(xì)胞凋亡明顯增加。給予線粒體通透性抑制劑CsA預(yù)處理，細(xì)胞的紅色熒光明顯變?nèi)?，其熒光?qiáng)度與對照組細(xì)胞幾乎相同，可見CsA有效阻斷了PA所致的細(xì)胞凋亡。

Fig 3 Influence of PA(0.4 mmol·L-1)on expression of mitochondrial apoptosis pathway protein in HUVECs n=3)

*P<0.05vs0 h group

Fig 4 Effects of PA(0.4 mmol·L-1) on apoptosis of HUVECs (scale bar: 50 μm)

TUNEL is red fluorescence. Fluorescence images of HUVECs stained with TUNEL after cells were incubated for 0 h (A), 12 h (B), 24 h (C) and 48 h (D) with 0.4 mmol·L-1PA.

Fig 5 Influence of mitochondrial apoptosis pathway inhibitor CsA on apoptosis of HUVECs exposed to PA (scale bar: 50 μm)

Fluorescence images of HUVECs stained with TUNEL after cells were incubated for 24 h with control (A), 0.4 mmol·L-1PA (B) and 0.4 mmol·L-1PA+10 μmol·L-1CsA (C).

3 討論

動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，其原因可以歸因于部分環(huán)境因素和部分先天性因素。這些環(huán)境因素和先天性因素雖然不能被認(rèn)定為動脈粥樣硬化的絕對病因，但在某種程度上可以歸結(jié)為誘發(fā)動脈粥樣硬化的高風(fēng)險(xiǎn)因素，其防治在臨床也越來越得到重視。不少文獻(xiàn)曾對此類高風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行過研究，其中高血脂被報(bào)道為動脈粥樣硬化的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素之一，受到廣泛關(guān)注，除此之外，還有糖尿病、吸煙、高血壓等[7-8]。近年來，動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究取得了一些成果，闡明了脂毒性內(nèi)皮損傷導(dǎo)致動脈粥樣硬化的部分機(jī)制，但其機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，尚不清楚其具體的深入機(jī)制?；诖?，本研究擬通過PA所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，探討高脂所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制。本研究中，當(dāng)PA刺激HUVECs，細(xì)胞存活率明顯降低，證實(shí)了脂毒性損傷對內(nèi)皮細(xì)胞增殖功能的影響，符合文獻(xiàn)報(bào)道。

內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是動脈粥樣硬化的起始階段[9-11]，研究表明，ROS和鈣離子是誘導(dǎo)凋亡的兩個(gè)重要因素[12-13]。ROS的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致鈣離子從線粒體釋放，過多的細(xì)胞內(nèi)鈣離子也會導(dǎo)致ROS形成增加，也引起了線粒體膜電位崩潰、ATP衰竭，從而促進(jìn)凋亡。研究表明，脂毒性刺激可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)[14]。而Bcl-2大多定位于線粒體外膜上，調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性，具有抑制凋亡的作用[15]。Bax是與Bcl-2共沉淀的一種蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。高脂刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的ROS，而ROS的產(chǎn)生會影響B(tài)cl-2和Bax的表達(dá)，進(jìn)而影響線粒體通透性，外膜孔徑變大，變大的線粒體孔徑導(dǎo)致線粒體中Cyt-C的釋放以及AIF的大量表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)線粒體釋放更多的Cyt-C，而被激活的caspase又促進(jìn)AIF的釋放，繼而引起caspase級聯(lián)反應(yīng)中具有代表意義的cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)，從而激活后續(xù)的細(xì)胞凋亡信號?？梢?，ROS誘導(dǎo)的線粒體凋亡機(jī)制可能參與了脂毒性內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的發(fā)病機(jī)制。本研究提示，PA刺激24 h時(shí)，HUVECs內(nèi)ROS水平明顯升高，此現(xiàn)象說明血管內(nèi)皮細(xì)胞可在高脂的刺激下出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激損傷。另一組實(shí)驗(yàn)說明，PA刺激HUVECs 24 h后，線粒體促凋亡通路蛋白AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3、Bax的表達(dá)明顯升高，線粒體抗凋亡通路蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯降低，Bax/Bcl-2的比值明顯升高，以上結(jié)果提示氧化應(yīng)激有可能通過激活線粒體凋亡通路，從而引起心肌細(xì)胞的損傷。本研究中，當(dāng)用線粒體通透性抑制劑CsA預(yù)處理時(shí)，PA所致的HUVECs凋亡明顯減少，提示阻斷線粒體凋亡通路可以明顯減輕高脂刺激對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，也進(jìn)一步證實(shí)了脂毒性血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與線粒體凋亡通路的相關(guān)性。

綜上所述，PA對血管內(nèi)皮細(xì)胞的脂毒性損傷，可通過氧化應(yīng)激-線粒體凋亡通路的激活，使細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，當(dāng)阻斷線粒體凋亡通路時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的脂毒性凋亡被明顯緩解?？傊€粒體凋亡通路的調(diào)控對高脂所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的防治有指導(dǎo)意義。

(致謝: 本文實(shí)驗(yàn)主要在延邊大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院藥學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室、基礎(chǔ)學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室、附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，由湖北科技學(xué)院醫(yī)藥研究院省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室協(xié)助完成。感謝廉麗花副教授、李晶副教授、碩士生馬偉平、金艷紅、權(quán)麗娜等對本實(shí)驗(yàn)的幫助與指導(dǎo)。)