李婉婷，韋立群，李 清，潘曉杭，黃道航，甘嘉亮，黃俊力，唐雙意

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部；2. 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；3. 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科；4.廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530021)

美國癌癥協(xié)會(huì)最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，2018年美國將有173萬癌癥病例和60多萬癌癥死亡病例，其中將有26 240個(gè)新增胃癌病例和10 800個(gè)胃癌死亡病例[1]。因此，胃癌是一個(gè)世界性公共衛(wèi)生問題，手術(shù)和化療是胃癌的主要治療手段[2]，在降低死亡率方面一直有效，但胃癌患者的5年生存率仍然相對(duì)較低[3]。因此，找到一種新的方法來治療胃癌至關(guān)重要。當(dāng)今各種新型的天然化合物，如足葉草毒素、紫杉醇、喜樹堿和長春堿，已經(jīng)被分離出來，并作為癌癥治療的有效藥物，但其副作用較大[4]。迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是一種天然的苯酚羧酸，它是一種次生代謝物，通常被用作烹飪草藥，常見于草本植物中，如迷迭香、鼠尾草、百里香和薄荷[5]。RA具有多種藥理作用，包括抗癌、抗微生物、抗過敏、抗炎、抗氧化等[6]?；赗A的藥理作用十分廣泛，本課題組前期合成了十幾種迷迭香酸類似物(rosmarinic acid analogue，RAA)[7]。通過篩選，我們發(fā)現(xiàn)迷迭香酸類似物-11(rosmarinic acid analogue-11，RAA-11)的細(xì)胞抗癌作用較為突出，其分子質(zhì)量為377.34，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見Fig 1。本課題擬用RAA-11作用于人胃癌MGC-803細(xì)胞，了解其對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)RAA提供理論依據(jù)。

Fig 1 Chemical structure of RAA-11

1 材料

1.1主要試劑及配制RAA-11由廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李清老師合成鑒定，純度≥98%(RAA-11溶于DMSO制成50 mmol·L-1儲(chǔ)備液，-20 ℃避光保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用含血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成高、中、低終濃度分別為40、20、10 μmol·L-1)。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Hoechst 33258 染色液(即用型)購自北京索萊寶科技有限公司；南美胎牛血清購自依科賽生物科技(太倉)有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國BD公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ERK、p-ERK、GAPDH、Bax、Bcl-2、caspase-3兔抗人單克隆抗體，購自美國CST公司。

1.2儀器全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；BX53熒光顯微鏡(日本奧林巴斯股份有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；電泳儀、半干轉(zhuǎn)印槽(美國Bio-Rad公司)；LI-COR Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株MGC-803購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫(由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科肖強(qiáng)課題組贈(zèng)予)，于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，長滿后，用0.25%胰酶消化傳代、凍存。

2.2MTT法常規(guī)培養(yǎng)人胃癌MGC-803細(xì)胞，待處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行消化，接種于96孔板，每孔100 μL，約5 000個(gè)/孔。貼壁后棄培養(yǎng)液，加入200 μL用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋的終濃度分別為0、10、20、40、80、160 μmol·L-1的RAA-11，每個(gè)劑量組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、36、48 h后，加入20 μL MTT，置37 ℃恒溫箱孵育4 h后，每孔加100 μL DMSO劇烈震蕩10 min，酶標(biāo)儀上490 nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值(OD)，細(xì)胞存活率=OD加藥組/OD對(duì)照組×100%。

2.3集落形成法取對(duì)數(shù)生長期的人胃癌MGC-803細(xì)胞進(jìn)行消化，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106·L-1，充分吹打成單細(xì)胞懸液后置于6孔板中，每孔500 μL。貼壁后，每孔分別加入2 mL用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋的終濃度為0、10、20、40 μmol·L-1的RAA-11，作用48 h后吸棄含藥培養(yǎng)基，隔天更換完全培養(yǎng)基，讓其生長2周(肉眼可見集落為準(zhǔn))，結(jié)束培養(yǎng)。PBS洗2次，室溫晾干后，用多聚甲醛固定15 min。棄多聚甲醛晾干，0.1%結(jié)晶紫染色20 min后，在倒置顯微鏡下拍照，集落抑制率=(集落數(shù)對(duì)照組-集落數(shù)加藥組)/集落數(shù)對(duì)照組×100%。

2.4Hoechst33258染色法取對(duì)數(shù)生長期的人胃癌MGC-803細(xì)胞進(jìn)行消化，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為2×107·L-1，接種到內(nèi)嵌有無菌處理的蓋玻片6孔板中，每孔2 mL。貼壁后，每孔分別加入2 mL用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋的終濃度為0、10、20、40 μmol·L-1的RAA-11。作用48 h后，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定20 min，每孔用0.5 mL Hoechst 33258室溫避光染色15 min，棄染色液，用PBS輕輕漂洗2遍。小心輕取蓋玻片，放在干凈載玻片上，加1滴抗熒光淬滅封片液(甘油 ∶PBS=1 ∶9)封片，于顯微鏡觀察。

2.5流式細(xì)胞術(shù)取對(duì)數(shù)生長期的人胃癌MGC-803細(xì)胞進(jìn)行消化，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1.5×108·L-1，接種到6孔板，每孔2 mL。貼壁后，每孔分別加入2 mL用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋的終濃度為0、10、20、40 μmol·L-1的RAA-11。作用48 h后收集細(xì)胞上清液，用胰酶消化貼壁細(xì)胞，將上清液和消化下的細(xì)胞1 000×g離心5 min。棄上清，加1 mL冰PBS重懸，1 000×g離心5 min，重復(fù)2次。棄PBS，加200 μL 1×Binding Buffer重懸后，加入5 μL PI和5 μL Annexin V，室溫避光孵育15 min，再加入300 μL 1×Binding Buffer，300目濾網(wǎng)過濾1次，于1 h內(nèi)上機(jī)。

2.6Westernblot取對(duì)數(shù)生長期的人胃癌MGC-803細(xì)胞進(jìn)行消化，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待其長到80%～90%左右，每瓶分別加入3 mL用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋的終濃度為0、10、20、40 μmol·L-1的RAA-11。作用48 h后，收集細(xì)胞上清液并消化細(xì)胞，PBS緩沖液洗3次后，加裂解液(RIPA ∶PMSF ∶Cocktail=100 ∶1 ∶1)冰上裂解20 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min。BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，上清液加上樣蛋白緩沖液煮沸變性5 min。取40 μg蛋白樣品先60 V恒壓電泳，待樣品電泳至分離膠后，將電壓換成120 V電泳至膠底部。半干轉(zhuǎn)印槽將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST洗膜3次，用5% BSA室溫封閉30 min，一抗冰上孵育過夜。二抗室溫避光孵育1 h，TBST避光洗膜3次后，用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描顯影。

3 結(jié)果

3.1RAA-11對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用Tab 1結(jié)果顯示，RAA-11對(duì)MGC-803細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，并存在濃度依賴性和時(shí)間依賴性。線性回歸結(jié)果得出RAA-11作用MGC-803細(xì)胞24、36、48 h的IC50分別是72.781、59.979、40.625 μmol·L-1。RAA-11作用MGC-803細(xì)胞48 h后，其濃度變化對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用較為突出，故選擇RAA-11作用MGC-803細(xì)胞48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Tab 1 Influence of RAA-11 on survival rate of human gastric cancer MGC-803 cells at different concentrations at different

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

3.2RAA-11對(duì)細(xì)胞集落形成的抑制作用如Fig 2所示，與對(duì)照組比較，不同濃度RAA-11作用胃癌MGC-803細(xì)胞48 h后，MGC-803細(xì)胞的克隆抑制率隨著藥物濃度升高而升高，RAA-11濃度0、10、20、40 μmol·L-1的克隆抑制率分別為15.8%、62.8%、81.4%、88.6%。抑制效果具濃度依賴性，與MTT法共同說明RAA-11可以有效抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖。

3.3RAA-11對(duì)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響如Fig 3所示，與對(duì)照組比較，RAA-11作用MGC-803細(xì)胞48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征，在熒光顯微鏡下呈強(qiáng)熒光反應(yīng)，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡率明顯上升。結(jié)果提示RAA-11對(duì)MGC-803細(xì)胞有一定的促凋亡作用。

3.4RAA-11對(duì)細(xì)胞凋亡的影響如Fig 4所示，RAA-11(0、10、20、40 μmol·L-1)作用于MGC-803細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率明顯升高。結(jié)果表明，RAA-11能夠引起MGC-803細(xì)胞的凋亡，且呈劑量依賴關(guān)系。

3.5RAA-11對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig 5的Western blot結(jié)果顯示，RAA-11作用于MGC-803細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組比較，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax和caspase-3表達(dá)增加，提示RAA-11可誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞的凋亡。

3.6RAA-11對(duì)細(xì)胞通路蛋白的影響如Fig 6所示，RAA-11作用于MGC-803細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組比較，通路蛋白ERK、p-ERK表達(dá)明顯下調(diào)，提示RAA-11可能通過抑制MAPK-ERK通路來誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡。

Fig 3 Influence of different concentrations of RAA-11 on nucleus apoptotic morphology and apoptotic rate of human gastric cancer MGC-803 cells(×200)

4 討論

RA是一種含多酚羥基的化合物，化學(xué)名稱為R(t)2-[[3-(3，4-二羥基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氧基]-3，4-二羥基苯丙酸，由一分子咖啡酸和一分子3，4-二羥基苯基乳酸縮合而成[8]，其成分主要為二萜酚類、黃酮類、三萜類、精油等。RA具有較好的水溶性和穩(wěn)定性，且具有抗氧化、抗菌、美容、抗腫瘤、消炎、抗心血管疾病等諸多作用[9]，近年來，其抗腫瘤效果頗受關(guān)注。RA植物來源豐富，可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[10]，作為抗腫瘤藥物具有良好的應(yīng)用前景。

細(xì)胞凋亡是最常見的細(xì)胞生理性死亡形式(即非病理性細(xì)胞死亡)，可發(fā)生于胚胎發(fā)育、組織重建、免疫調(diào)節(jié)及腫瘤退化的各個(gè)時(shí)期[11]。caspase-3

A:RAA-11 0 μmol·L-1; B: RAA-11 10 μmol·L-1;C:RAA-11 20 μmol·L-1;D:RAA-11 40 μmol·L-1; E:Histogram of cell apoptosis rate.**P<0.01vs0 μmol·L-1group.

是一種含有277個(gè)氨基酸殘基的蛋白酶，分子質(zhì)量約32 ku，是caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶之一。其下游因子Bcl-2是一種癌基因，它具有抑制凋亡的作用，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Bcl-2蛋白家族按功能可分為兩類：一類是像Bcl-2一樣具有抑制凋亡作用，如Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、A1等;而另一類具有促進(jìn)凋亡作用，如Bax、Bcl-xS、Bik/Nbk、Bid等[12]。我們的研究顯示，RAA-11能夠促進(jìn)凋亡啟動(dòng)因子caspase-3和促凋亡因子Bax的表達(dá)，抑制抑凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，提示RAA-11能夠誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞的凋亡。

ERK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是傳遞絲裂原信號(hào)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白[13]。它正常定位于胞質(zhì)，當(dāng)激活后轉(zhuǎn)位至胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)。已知ERK家族有5個(gè)亞族，包括ERK1～ERK5，其中ERK1和ERK2途徑是ERK家族中研究最徹底的[14]。ERK調(diào)節(jié)著細(xì)胞的增殖、分化和存活，是多種生長因子(EGF、NGF、PDGF等)的下游蛋白。ERK及其信號(hào)途徑在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起中介和放大信號(hào)的作用：一方面，接受大量來自生長因子、絲裂原、環(huán)境刺激等的信號(hào)；另一方面，通過ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)作用于核轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1、NF-κB等，調(diào)控基因表達(dá)。在許多人類的癌癥(如口腔癌、黑色素瘤、乳腺癌等)中都可發(fā)現(xiàn)ERK的過度激活[15]。本研究顯示，RAA-11明顯下調(diào)了通路蛋白ERK、p-ERK的表達(dá)量，我們猜想RAA-11可能通過抑制ERK/MAPK通路，抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

Fig 5 Influence of different concentrations of RAA-11 on apoptosis related protein expressions in human gastric cancer MGC-803

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

Fig 6 Influence of different concentrations of RAA-11 on ERK pathway protein expressions in human gastric cancer MGC-803

**P<0.01vs0 μmol·L-1group

綜上所述，本研究顯示，RAA-11能夠有效抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。然而，RAA-11這些效應(yīng)的確切機(jī)制仍不清楚。我們的初步研究結(jié)果表明，RAA-11誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡可能與其抑制ERK/MAPK通路有關(guān)，為RAA-11的開發(fā)與應(yīng)用奠定了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。