段菁菁 王志新 董瓊

[摘要]以異葉茴芹為材料，用有機(jī)溶劑乙醇作為提取劑，結(jié)合超聲波提取法對(duì)異葉茴芹多酚進(jìn)行提取。用單因素實(shí)驗(yàn)法分別考察不同提取條件（乙醇濃度、料液比、超聲溫度及時(shí)間）對(duì)異葉茴芹多酚提取量的影響，得出單因素最佳提取條件為料液比1：100、乙醇濃度40%、超聲時(shí)間80min、超聲溫度60℃。再進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，篩選多酚提取條件。結(jié)果表明，超聲輔助提取異葉茴芹多酚最佳提取條件為料液比1：110、乙醇濃度50%、超聲時(shí)間100min、超聲溫度60℃。

[關(guān)鍵詞]異葉茴芹;多酚;超聲輔助提取

[中圖分類(lèi)號(hào)]R284.2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

異葉茴芹（Pimpinella diversifolia DC.）屬傘形科茴芹屬多年生草本植物，分布廣泛，產(chǎn)湖南、浙江、廣東、安徽等地，在國(guó)外分布于越南、阿富汗、尼泊爾等地。異葉茴芹常生長(zhǎng)在山腳下和路邊草叢的陰濕處，濕地山溝等地。異葉茴芹被當(dāng)作一種常見(jiàn)的中草藥，有祛除風(fēng)寒、消除腫痛等功效。可用于醫(yī)治風(fēng)寒感冒、咳嗽、結(jié)核、痢疾、小兒疳積。也可將新鮮的異葉茴芹磨碎外敷，用于治療血液循環(huán)毒素中毒、化膿性炎癥、全身性瘙癢癥等。植物多酚是一類(lèi)具有大分子質(zhì)量的多元酚類(lèi)化合物，是廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝物。多酚含有多種生物活性，可除去機(jī)體內(nèi)過(guò)量的自由基，同時(shí)起著保護(hù)機(jī)體內(nèi)大分子物質(zhì)的作用。多酚也能夠?qū)C(jī)體內(nèi)的脂肪代謝產(chǎn)生重要的作用，可被用于治療心腦血管疾病。此外，多酚還具有一定的抗腫瘤活性，能夠有效地防癌抑癌，有極大的應(yīng)用前景。盡管目前植物多酚提取的方法多樣，所用的植物材料來(lái)源豐富，但關(guān)于異葉茴芹多酚的提取研究和報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超聲輔助提取異葉茴芹多酚，利用單因素實(shí)驗(yàn)法考察影響異葉茴芹多酚提取量的主要因素，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，得出異葉茴芹多酚提取的最優(yōu)提取條件，為今后異葉茴芹多酚開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

TD5A-WS臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司），XY-C電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司），BJ-150多功能粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司），ZQ6-180R單槽式超聲清洗儀（上海爭(zhēng)巧科學(xué)儀器有限公司），2721G可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）。

材料和試劑：異葉茴芹購(gòu)自浙江省溫州市永嘉縣。無(wú)水乙醇;沒(méi)食子酸;無(wú)水碳酸鈉，以上試劑均為分析純。福林酚試劑（BR級(jí)）：1mol·L-1。

1.2 方法

1.2.1 異葉茴芹多酚提取。用粉碎機(jī)將干燥的異葉茴芹粉碎，過(guò)60目篩，密封保存。稱(chēng)量1g異葉茴芹粉末，加入乙醇溶液，設(shè)置不同的單因素實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行超聲處理，其中按實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)設(shè)定相應(yīng)的乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度。在50mL的離心管內(nèi)加入經(jīng)超聲處理后的提取液后于3000r·min-1下離心10min，待離心機(jī)停止運(yùn)行時(shí)，再將離心管內(nèi)的液體部分倒出，用蒸餾水定容到200mL，得到待測(cè)液。室溫密封保存。

1.2.2 異葉茴芹多酚提取量的測(cè)定。參考張瑛的實(shí)驗(yàn)方法稍作修改，稱(chēng)量質(zhì)量為0.1g的沒(méi)食子酸純凈粉末，使其溶于70%的乙醇溶液中，定容，得100mL的沒(méi)食子酸樣液。取10mL沒(méi)食子酸樣液，再用70%乙醇定容到100mL，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度為100?g·mL-1。

取六個(gè)10mL容量瓶，依次加入體積為50?L至300?L的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，每份相差50?L。依次加入1950?L至1700?L蒸餾水，每份相差50?L。各加1mL福林酚，混勻，放置5min，此操作過(guò)程需要在暗處進(jìn)行。分別加10%的碳酸鈉溶液1mL，混勻后遮光靜置2h。760nm下測(cè)定吸光值，計(jì)算得到線性回歸方程。

移取0.5mL待測(cè)液置于10mL容量瓶，采用和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同方法測(cè)吸光值，按下式計(jì)算：

式中：E代表多酚提取量（mg·g-1），X代表異葉茴芹待測(cè)液中多酚的濃度（μg·mL-1），V代表提取溶液定容后的體積（mL），M代表粉末狀異葉茴芹的質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)。分別考察料液比（1：80、1：90、1：100、1：110、1：120）、乙醇濃度（20%、30%、40%、50%、60%、70%）、超聲溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）以及超聲時(shí)間（20min、40min、60min、80min、100min）對(duì)于異葉茴芹多酚提取量的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)。通過(guò)之前的實(shí)驗(yàn)分析，得到最優(yōu)的單因素提取數(shù)值，再進(jìn)行L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=0.1145x+0.0153，R2為0.9939。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)異葉茴芹多酚提取量的影響。由圖1可知，異葉茴芹提取液中的多酚含量隨著物料與液體比例的減小呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，在圖中橫坐標(biāo)料液比為1：100時(shí)對(duì)應(yīng)有最大的多酚提取量。當(dāng)提取溶劑的體積增大時(shí)，異葉茴芹粉末能夠與溶劑更充分地接觸，促使溶液中的多酚被更充分地提取出來(lái)。若提取劑太少，異葉茴芹含有的多酚不能被充分提取出來(lái)，當(dāng)溶劑體積逐漸增大，多酚的提取量也逐漸增大，溶劑到達(dá)一定體積時(shí)，多酚已被基本提取出來(lái)。再繼續(xù)增大溶劑的體積，不僅會(huì)造成溶劑的浪費(fèi)，也讓超聲波造成的機(jī)械效應(yīng)變得不再明顯，使多酚提取量減少。

2.2.2 乙醇濃度對(duì)異葉茴芹多酚提取量的影響。由圖2可知，異葉茴芹多酚提取量隨著乙醇濃度的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，乙醇濃度為40%時(shí)，異葉茴芹多酚的提取量最大。多酚易溶于乙醇。逐漸增大乙醇濃度，使得多酚能夠充分溶解在乙醇和水的復(fù)合體系中。接著增大乙醇的濃度，異葉茴芹多酚的提取量反而降低，是由于一些易溶于水的多酚存在于植物細(xì)胞的液泡當(dāng)中，當(dāng)乙醇的濃度過(guò)大時(shí)，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)變性，阻礙了液泡中的多酚被提取，降低了提取液中多酚的含量。

2.2.3 超聲溫度對(duì)異葉茴芹多酚提取量的影響。由圖3可知，異葉茴芹多酚提取量伴隨超聲溫度的升高而增大，超聲溫度達(dá)60℃時(shí)，異葉茴芹多酚提取量最大，超聲溫度大于60℃，異葉茴芹多酚提取量開(kāi)始減少。因?yàn)闇囟壬邥?huì)使分子的擴(kuò)散速率加快，導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)多酚的提取速率和提取量增大，溫度高于60℃，會(huì)引起一些聚合反應(yīng)以及氧化還原反應(yīng)的產(chǎn)生，使得異葉茴芹的多酚提取量降低。另外，有機(jī)溶劑具有揮發(fā)性，異葉茴芹中某些其他成分在溶液內(nèi)的溶解度會(huì)伴隨乙醇的揮發(fā)而增大，影響測(cè)量的結(jié)果，使得異葉茴芹多酚的提取量降低。

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)異葉茴芹多酚提取量的影響。由圖4可知，一定時(shí)間范圍內(nèi)，超聲時(shí)間延長(zhǎng)，異葉茴芹多酚提取量增大。超聲時(shí)間達(dá)80min時(shí)異葉茴芹多酚提取量最大，在80min后便開(kāi)始減少。因?yàn)楫惾~茴芹多酚溶出至提取液需要一定時(shí)間，當(dāng)提取時(shí)間過(guò)短時(shí)，異葉茴芹多酚沒(méi)有被充分提取出來(lái)，隨著超聲時(shí)間的增加，多酚提取量不斷上升，在超聲時(shí)間為80min時(shí)，異葉茴芹多酚被充分地提取出來(lái)。但若超聲時(shí)間太長(zhǎng)，則會(huì)因長(zhǎng)時(shí)間的高溫作用，致使多酚的分子構(gòu)象發(fā)生變化，降低提取量，并且也增加不必要的生產(chǎn)成本。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，如表1所示。從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2中可知，RD>RC>RA>RB，由此可知，異葉茴芹多酚提取量的最大影響因素和最小影響因素分別是超聲溫度和乙醇濃度。提取異葉茴芹多酚的最優(yōu)條件為A3B3C3D2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助乙醇法從異葉茴芹中提取多酚，得出單因素最適條件為乙醇濃度40%，料液比1：100，超聲時(shí)間和溫度為80min和60℃。進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)最終得到異葉茴芹多酚提取的最佳條件：乙醇濃度50%，料液比1：110，超聲時(shí)間及溫度分別為100min和60℃。其中，對(duì)異葉茴芹多酚提取量影響最大的因素是超聲溫度，影響最小的是乙醇濃度。

本實(shí)驗(yàn)選取乙醇和水的復(fù)合體系作為提取劑。姚永志的研究表明用乙醇這類(lèi)有機(jī)溶劑比用水作為提取劑的多酚提取率大。且乙醇與其他常見(jiàn)的有機(jī)溶劑（乙醚、乙酸乙酯等）相比，對(duì)人體的危害較小，成本低，后續(xù)廢液的收集及處理方便。但濃度過(guò)高的乙醇會(huì)使蛋白質(zhì)變性，使得水溶性多酚難以被提取出來(lái)，影響多酚的提取量，因此選擇濃度適宜的乙醇溶液作為提取劑就尤為重要。本實(shí)驗(yàn)初期設(shè)置了多個(gè)乙醇濃度梯度，濃度分別為20%至70%，組成一組含六個(gè)濃度梯度的單因素實(shí)驗(yàn)組，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次得出最佳乙醇濃度為40%。

本實(shí)驗(yàn)選擇超聲輔助提取的辦法，超聲波可導(dǎo)致植物細(xì)胞壁破裂開(kāi)來(lái)，使得異葉茴芹中的多酚更好地滲出，大大提高了提取效率和多酚提取量。有學(xué)者在研究中比較了幾種植物多酚的提取方法，如李青在研究皇冠梨的多酚提取工藝時(shí)，使用了有機(jī)溶劑法、微波輔助提取法和超聲波輔助法，發(fā)現(xiàn)超聲波輔助法提取皇冠梨多酚的提取率最高。超聲提取比其它提取方法更具優(yōu)勢(shì)，其操作程序簡(jiǎn)單，耗能較少，提取率高，以及操作風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較小。因此，在本研究中選擇超聲波輔助提取的辦法。

不同實(shí)驗(yàn)材料受提取條件各因素影響的程度不同，劉德明提取金蕎麥莖葉中的多酚，發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間為關(guān)鍵影響條件。呂丹提取山楂皮中總多酚，結(jié)果表明乙醇濃度對(duì)總多酚提取率有最大影響。本實(shí)驗(yàn)中異葉茴芹多酚提取量的關(guān)鍵影響因素為超聲溫度，且在溫度為60℃時(shí)，異葉茴芹多酚提取量達(dá)到最高。隨溫度升高，提取溶液系統(tǒng)的熱能升高，分子熱運(yùn)動(dòng)速率加快，利于多酚提取。但隨超聲溫度的升高，提取劑中乙醇更容易揮發(fā)，影響異葉茴芹多酚的提取，控制超聲溫度尤為關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)采用福林酚法測(cè)定異葉茴芹提取液中的多酚含量，需要注意控制提取液中多酚與福林酚發(fā)生反應(yīng)的時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)參照實(shí)驗(yàn)方案中所及文獻(xiàn)，選擇反應(yīng)時(shí)間為2h，并統(tǒng)一反應(yīng)時(shí)間，避免造成實(shí)驗(yàn)誤差過(guò)大。本實(shí)驗(yàn)雖已對(duì)異葉茴芹多酚的超聲提取工藝進(jìn)行一定的優(yōu)化，但未與其它異葉茴芹多酚提取方法進(jìn)行比較。另外，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)異葉茴芹全株多酚進(jìn)行提取和測(cè)定，未對(duì)植株不同部位的多酚含量進(jìn)行深入研究，建議后續(xù)工作可嘗試多種多酚提取方法，以及比較異葉茴芹不同部位的多酚含量，更合理地開(kāi)發(fā)和利用異葉茴芹。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志（第五十五卷第二分冊(cè)）[M].北京：科學(xué)出版社，1985.

[2] 危英，張旭，危莉，等.黔產(chǎn)異葉茴芹揮發(fā)油化學(xué)成分的研究[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004（01）：62-63.

[3] 董立莎，趙志華.民藥異葉茴芹的生藥鑒定[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1991（03）：62-64.

[4] 林櫻姬，趙萍，王雅.植物多酚的提取方法和生物活性研究進(jìn)展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，55（06）：105-107.

[5] 張瑛.花生衣多酚的提取、純化及其活性研究[D].太原：山西大學(xué)，2016.

[6] 潘匯.荷葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的提取，分離及抗氧化構(gòu)效關(guān)系的研究[D].蕪湖：安徽工程大學(xué)，2018.

[7] 鄭賢明.橄欖葉多酚提取純化及抗氧化活性的研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

[8] 李華，王蔚新，袁春龍.葡萄籽多酚提取物的提取工藝研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2005（06）：69-72.

[9] 鄭濤.青杄針葉多酚提取工藝及抗氧化活性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

[10] 姚永志，左錦靜，王子涵.乙醇提取花生紅衣多酚物質(zhì)的研究[J].中國(guó)油脂，2007（03）：51-53.

[11] 姚永志，王子涵，左錦靜.水作溶劑提取花生紅衣多酚物質(zhì)的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2006（04）：110-112.

[12] 李青.武威地區(qū)皇冠梨中多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[13] 劉德明，劉永賢，鄧娜，等.金蕎麥地上部莖葉中多酚的提取工藝研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2019（06）：225-227.

[14] 呂丹，唐克慧，王宇弛，等.同步提取山楂皮中總多酚、總黃酮和三萜類(lèi)物質(zhì)的工藝優(yōu)化[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，39（05）：69-75.