龔琴，王木蘭，何鹿玲，馮育林，楊世林，杜力軍，3，李俊*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330006；2.創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006；3.清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084

白頭翁Pulsatillachinensis(Bge.)Regel是臨床常用中藥，具有清熱解毒、止痢、燥濕的作用。常用于濕熱痢疾等濕熱證[1]。白頭翁中分離得到多種皂苷類化合物[2-4]，這類化合物具有抗炎、抑瘤等作用[5-13]。白頭翁皂苷B4(簡(jiǎn)稱B4)為白頭翁皂苷中主要單體成分之一，屬五環(huán)三萜皂苷類化合物，結(jié)構(gòu)母核為23-羥基白樺酸。國(guó)內(nèi)外對(duì)于B4的藥理研究報(bào)道甚少，僅見(jiàn)少量關(guān)于抗肝癌、抗炎作用的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，以及B4在潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)于急性腎損傷尚未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，白頭翁中含量較高的主要成分白頭翁皂苷B4具有較好的抗炎作用，對(duì)于體外脂多糖(LPS)所致人胚腎細(xì)胞HEK293損傷具有一定的防治作用。為進(jìn)一步證明B4具有防治腎功能損傷的作用，本團(tuán)隊(duì)利用多種常用方法所致動(dòng)物急性腎功能損傷模型，從整體動(dòng)物水平進(jìn)一步確證B4的相關(guān)藥效，同時(shí)還進(jìn)行了小鼠LD50的測(cè)定，以期全面反映該藥潛在的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

HEK293、人胚腎細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù))。

1.2 動(dòng)物

SD大鼠，體質(zhì)量160～220 g，雄性，用于甘油所致大鼠急性腎損傷實(shí)驗(yàn)；ICR小鼠，體質(zhì)量16～18 g，雄性，用于順鉑所致急性腎損傷實(shí)驗(yàn)；Balb/c小鼠，體質(zhì)量21～23 g，雄性，用于LPS致急性腎損傷實(shí)驗(yàn)；ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雄雌各半，用于急性毒性實(shí)驗(yàn)。上述大小鼠均購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002(小鼠)，許可證號(hào)：SCXK(湘)2013-0004(大鼠)。

1.3 藥物與試劑

白頭翁皂苷B4(anemoside B4，C59H96O26，分子量：1221.39，PubChem CID：11636713，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/71307558，分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。)，由本室植化組提供，純度大于98%(HPLC法)，批號(hào)：20161107。

圖1 白頭翁皂苷B4化學(xué)結(jié)構(gòu)

地塞米松，0.75g/片，安徽金太陽(yáng)生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)：15032521。甘油(西隴化工股份有限公司，AR，含量﹥99%，批號(hào)：160320，臨用前取甘油加等量的0.9%氯化鈉溶液稀釋成50%甘油溶液備用。順鉑(江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，5 mg·mL-1，批號(hào)：170503)，臨用前用0.9%氯化鈉溶液配成1.5 mg·mL-1溶液備用。脂多糖(LPS，Sigma公司，Lipopolysaccharides from Escherichia coli O555：B5，L2880-100MG，批號(hào)：017M4112V)，臨用前用0.9%氯化鈉溶液配成1.0 mg·mL-1溶液備用。BUN、TP生化試劑盒(日本純藥工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)分別為TR368、DF774)。Cre生化試劑盒(北京利德曼生化股份有限公司，批號(hào)：7082216)。Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0006，北京碧云天生物技術(shù)公司)。DMEM/HIGH CLUCOSE培養(yǎng)基(Hyclone，LOT No：AC10253739)。澳洲胎牛血清(Hyclone，貨號(hào)：SH30084.03)。TRIzol(ambion公司)，LOT：15991210。Realtime PCR Super mix(MF013-01，北京聚合美生物科技有限責(zé)任公司，LOT：20170911)。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，基因序列如下：GAPDH，forward，5′-GGTGACTAACCCTGCGCT-3′，reverse，5′-TGACCAGGCGCCCAATAC-3′。TNF-α，forward，5′-AGCACTGAAAGCATCATCCG-3′，reverse，5′-CCGATCACTCCAAAGTGCA-3′。

1.4 儀器

Spectra Max i3型多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)，7100型全自動(dòng)生化分析儀(日立公司)，TDZ4型臺(tái)式低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)，超凈工作臺(tái)[日本，SANYO MCV-B161S(T)]，CO2培養(yǎng)箱(日本，SANYO MCO-20ACI)，倒置顯微鏡(日本，OLYMPUS CKX4I)，7500熒光定量PCR儀(AB公司)，5810R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)。

2 方法

2.1 B4抗LPS致HEK293細(xì)胞損傷

用DMEM高糖培養(yǎng)基將細(xì)胞復(fù)蘇、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)消化后收集細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度為4.5×104個(gè)/mL，每孔接種100 μL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄去細(xì)胞上清液加入100 μL終質(zhì)量濃度10 μg·mL-1的LPS誘導(dǎo)損傷，24 h后加入B4干預(yù)，B4終質(zhì)量濃度為1、10、100 μg·mL-1，同時(shí)設(shè)置正常組(即不加LPS和B4)及模型組(即加LPS不加B4)。MTT法檢測(cè)給藥24 h和48 h細(xì)胞的活性(細(xì)胞活性=給藥組平均吸光度/正常組平均吸光度×100%)。以上同樣方法LPS誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，收集B4給藥24、48 h的細(xì)胞，按照試劑盒操作說(shuō)明制備mRNA，并進(jìn)行qPCR檢測(cè)細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)。

2.2 B4抗甘油所致大鼠急性腎功能損傷

取雄性SD大鼠，隨機(jī)分為6組，每組10只。正常組、模型組、陽(yáng)性組(地塞米松0.3 mg·kg-1)、B4高劑量組(2.5 mg·kg-1)、B4中劑量組(1.25 mg·kg-1)、B4低劑量組(0.625 mg·kg-1)。造模前禁水24 h，造成動(dòng)物脫水，按10 mL·kg-1的體積分別在大鼠兩后肢內(nèi)側(cè)肌肉內(nèi)注射50%甘油溶液，復(fù)制急性腎損傷模型，造模后恢復(fù)飲水[14-15]。從造模當(dāng)天開(kāi)始連續(xù)給藥4 d，正常組、陽(yáng)性組灌胃給藥(給藥容積10 mL·kg-1)，模型組、B4組尾靜脈注射(給藥容積5 mL·kg-1)。末次給藥后1 h，大鼠異氟烷麻醉后眼球取血，分離血清，采集膀胱尿，檢測(cè)總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)、尿蛋白。

2.3 B4抗順鉑所致小鼠急性腎功能損傷

取雄性ICR小鼠，隨機(jī)分為6組。按順鉑15 mg·kg-1的劑量造模，正常組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，其他組腹腔注射順鉑注射液[16]。陽(yáng)性組地塞米松給藥劑量為0.5 mg·kg-1(灌胃給藥，給藥容積20 mL·kg-1)，B4給藥劑量分別為10 mg·kg-1、5 mg·kg-1、2.5 mg·kg-1(尾靜脈注射，注射容積10 mL·kg-1)，模型組尾靜脈注射等容積的0.9%氯化鈉溶液，正常組灌胃等容積雙蒸水。從造模當(dāng)天開(kāi)始連續(xù)給藥4 d，末次給藥后1 h眼球取血，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)。

2.4 B4抗LPS所致小鼠急性腎功能損傷

取雄性Balb/c小鼠，隨機(jī)分為6組，每組15只。LPS靜脈注射造模(劑量10 mg·kg-1)[17]。造模后6 h，各組給予不同劑量的藥物，經(jīng)過(guò)多次預(yù)試驗(yàn)，最終確定B4給藥劑量分別為20、10、5 mg·kg-1(尾靜脈注射，給藥容積10 mL·kg-1)，陽(yáng)性組地塞米松給藥劑量為0.5 mg·kg-1(灌胃給藥，容積20 mL·kg-1)。模型組腹腔注射等容積0.9%氯化鈉溶液，正常組灌胃等容積的雙蒸水。給藥后6 h(即造模后12 h)眼眶取血，分離血清，檢測(cè)總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)。

2.5 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

取ICR小鼠60只，雄雌各半。隨機(jī)分為6組，每組10只。對(duì)照組、B4的5個(gè)劑量組，劑量分別為6、4.8、3.84、3.07、2.46 g·kg-1，每組組間劑量比為1∶0.8。B4各劑量組尾靜脈注射不同劑量的藥物，給藥容積為20～25 mL·kg-1，對(duì)照組注射20 mL·kg-1體積的0.9%氯化鈉溶液，給藥1次，觀察2周。給藥后觀察動(dòng)物體質(zhì)量變化(每周稱一次)、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物、死亡情況(記錄累積死亡數(shù))及中毒反應(yīng)(中毒反應(yīng)的癥狀、嚴(yán)重程度、起始時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、是否可逆)等。對(duì)瀕死及死亡動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行大體解剖，其他動(dòng)物在觀察期結(jié)束后進(jìn)行大體解剖，觀察動(dòng)物主要臟器肝、脾臟、胸腺、腎、肺、心臟、小腸、胃等，對(duì)異常臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)死亡數(shù)計(jì)算死亡率，計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)及95%可信限。

2.6 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 B4對(duì)LPS致HEK293細(xì)胞損傷的影響

結(jié)果顯示，10 μg·mL-1的LPS誘導(dǎo)24 h后細(xì)胞活性明顯下降，且炎性因子TNF-α表達(dá)顯著上調(diào)，B4給藥24、48 h后劑量1 μg·mL-1可明顯增加細(xì)胞活性，且10 μg·mL-1及1 μg·mL-1能明顯下調(diào)TNF-α mRNA的表達(dá)，提示B4對(duì)LPS誘導(dǎo)的腎細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用(見(jiàn)圖2)。

注：A.B4對(duì)LPS致HEK293損傷細(xì)胞活性的影響；B.B4給藥24 h對(duì)LPS致細(xì)胞損傷TNF-α mRNA表達(dá)的影響；C.B4給藥48 h對(duì)LPS致細(xì)胞損傷TNF-α mRNA表達(dá)的影響；與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

3.2 B4對(duì)甘油所致大鼠腎功能損傷的影響

模型組血清中BUN、Cre及其尿蛋白較正常組明顯升高。B4靜脈給藥后高、中劑量組大鼠血清BUN、Cre明顯下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B4高劑量組大鼠尿蛋白濃度明顯下降(P<0.05)，表明B4對(duì)甘油所致大鼠急性腎損傷有一定的保護(hù)作用。陽(yáng)性對(duì)照藥地塞米松也在一定程度上保護(hù)腎功能，但對(duì)尿蛋白無(wú)明顯作用，各組大鼠血清總蛋白量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3)。

注：A.B4對(duì)TP的影響；B.B4對(duì)Cre的影響；C.B4對(duì)BUN的影響；D.B4對(duì)尿蛋白的影響；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；NS表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 B4對(duì)順鉑所致小鼠腎功能損傷的影響

模型組血清中BUN、Cre較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B4(10 mg·kg-1)、B4(5 mg·kg-1)組血清BUN、Cre明顯下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示B4對(duì)順鉑所致急性腎損傷有一定的保護(hù)作用，能顯著降低急性腎損傷時(shí)的BUN、Cre。陽(yáng)性組血清BUN明顯下降(P<0.05)，對(duì)Cre無(wú)明顯作用。B4各組小鼠血清總蛋白量無(wú)明顯差異。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 B4對(duì)順鉑所致小鼠急性腎功能損傷的影響

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 B4對(duì)LPS所致小鼠腎功能損傷的影響

模型組靜脈注射LPS 12 h后，小鼠血清總蛋白明顯下降，BUN和Cre明顯升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。給藥后6 h，B4的3個(gè)劑量組血清BUN明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但對(duì)Cre則未表現(xiàn)出明顯的作用。陽(yáng)性藥對(duì)血清BUN也表現(xiàn)出明顯的下調(diào)作用。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 B4對(duì)LPS致小鼠急性腎功能損傷的影響

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.5 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

靜脈注射不同劑量的B4，各組小鼠表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ劑量組動(dòng)物給藥后自主活動(dòng)減少，對(duì)外反應(yīng)冷漠，部分動(dòng)物出現(xiàn)豎毛、消瘦等現(xiàn)象。劑量Ⅰ、Ⅱ組動(dòng)物死亡時(shí)間主要集中在給藥后24～36 h，劑量Ⅲ組死亡時(shí)間在給藥后36 h，劑量Ⅳ組動(dòng)物死亡時(shí)間為給藥后72 h內(nèi)，Ⅴ劑量組無(wú)動(dòng)物死亡。各組小鼠死亡率見(jiàn)表3。采用寇氏式法計(jì)算，B4靜脈注射給藥小鼠LD50值為3.36 g·kg-1，95%可信限為3.34～3.37 g·kg-1。

表3 B4靜脈注射給藥所致小鼠死亡率

注：“()”為雄性小鼠死亡數(shù)。

4 討論

本研究利用甘油、順鉑和LPS造模，觀察了B4對(duì)急性腎功能損傷的保護(hù)作用。甘油引起急性腎功能損傷的原理是肌肉注射甘油后，由于禁水及甘油的高滲透壓造成局部體液蓄積而引起血容量降低，腎血流量減少，血液黏度增加，腎血管阻抗增加，血管自身調(diào)節(jié)功能喪失，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)率下降。另外，高滲透壓造成肌肉及肌肉血管的溶解，肌紅蛋白、血紅蛋白及鉀的釋放產(chǎn)生腎毒性最終造成腎小球及腎小管損傷[19-21]。順鉑為一臨床常用的非特異性抗腫瘤藥，其細(xì)胞毒性對(duì)腫瘤進(jìn)行殺傷的同時(shí)，也不可避免地對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生毒性，因此順鉑在抗腫瘤過(guò)程中常導(dǎo)致腎功能損傷已為臨床所常見(jiàn)[22]。腹腔注射順鉑后，可引起腎血管收縮，腎血流量及腎小球?yàn)V過(guò)率下降，從而引起蛋白尿、腎功能損傷等癥狀[23-24]，對(duì)腎臟的不同部位均有毒性，可使腎小球、腎小管功能及形態(tài)學(xué)改變。LPS誘導(dǎo)的急性腎損傷是其通過(guò)激活TLR2/4信號(hào)通路，刺激組織細(xì)胞炎性壞死因子表達(dá)，進(jìn)而對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷，其中以腎功能損傷較為明顯[25-27]。我們利用上述3種常規(guī)方法對(duì)B4防治急性實(shí)驗(yàn)性腎功能損傷的作用進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明，B4對(duì)這3種模型的急性腎功能損傷均有明顯的保護(hù)作用，同時(shí)根據(jù)體外LPS致人胚腎細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示B4對(duì)LPS所致炎癥反應(yīng)有明顯抑制作用，提示該藥在此方面的潛在的藥用價(jià)值。

急性腎損傷主要是炎性壞死病理反應(yīng)，其中最常發(fā)生變化的就是TLR4及其下游信號(hào)通路，如核因子NFκB及炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6等。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)在多種腎臟疾病中發(fā)揮著重要的作用，尤其是TLR2和TLR4[28]。綜合文獻(xiàn)關(guān)于B4具有抗炎抗癌作用以及抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的藥代相關(guān)研究報(bào)道，可見(jiàn)B4對(duì)于炎癥反應(yīng)具有一定抑制作用。同時(shí)本研究在甘油致大鼠的急性腎損傷的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，B4可降低腎損傷大鼠尿液中白蛋白量，提示其對(duì)腎小球?yàn)V過(guò)功能有一定的修復(fù)作用，對(duì)于B4抗腎損傷作用機(jī)制研究可從改善腎小球?yàn)V過(guò)功能，如腎小球基底膜上的足細(xì)胞等方面開(kāi)展。關(guān)于B4對(duì)急性腎損傷的保護(hù)作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

在急性腎功能損傷模型的實(shí)驗(yàn)中，B4對(duì)不同原因的模型所用劑量不同。其中對(duì)LPS所致急性腎功能損傷的有效劑量在5～20 mg·kg-1。而對(duì)順鉑所致急性腎功能損傷的有效劑量在5～10 mg·kg-1，2.5 mg·kg-1劑量未表現(xiàn)出明顯的作用。在甘油所致大鼠急性腎功能損傷模型實(shí)驗(yàn)中，B4的有效劑量在1.25～2.50 mg·kg-1，按照大小鼠體表面積計(jì)算，此劑量相當(dāng)于小鼠的2.5～5.0 mg·kg-1。由此提示對(duì)于實(shí)驗(yàn)性急性腎功能損傷模型實(shí)驗(yàn)中，B4的有效劑量在5～20 mg·kg-1，當(dāng)然最終有效劑量的確定還需要更多實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，其中對(duì)慢性腎功能損傷的作用有待于進(jìn)一步研究。

小鼠以B4靜脈給藥，LD50為3.36 g·kg-1，毒性較小。以最大有效劑量20 mg·kg-1計(jì)，B4的臨床安全指數(shù)(safety index)為168(3.36/0.02)，提示B4在防治急性腎功能損傷方面的安全系數(shù)較大。在急性毒性實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)，B4毒性的產(chǎn)生有一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，即劑量在3.84～3.07 mg·kg-1時(shí)，劑量為3.84 mg·kg-1時(shí)，小鼠死亡率為100%；而劑量降至3.07 mg·kg-1時(shí)，小鼠死亡率明顯下降至僅為10%。B4表現(xiàn)出毒性的驟然性變化，其中的機(jī)制尚待于進(jìn)一步研究。

綜上，B4以其毒性較低、治療指數(shù)較高等特點(diǎn)，在防治急性腎功能損傷方面具有一定的藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值，本工作提供了重要的實(shí)驗(yàn)參考。